Her presenterer vi en standardisert protokoll for å måle nasal potensielle forskjellen (OD). Cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator (CFTR) og epithelial natrium kanal (ENaC)-funksjonen evalueres etter endringen i spenning over nasal epitel etter superfusion løsninger som endrer ion kanal aktivitet, gir en utfallet tiltaket.
Vi beskriver en standardisert måling av nese potensielle forskjellen (OD). I denne teknikken overvåkes cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator (CFTR) og funksjonen epithelial natrium kanal (ENaC) av endringen i spenning over nasal epitel etter superfusion løsninger som endrer ion kanal aktivitet. Dette aktiveres ved måling av potensielle forskjellen subkutan rommet og luftveier epitel i neseboret, utnytte et kateter i kontakt med en dårligere nasal Concha.
Testen kan måling av stabil planlagte spenningen og den påfølgende netto spenning endringene etter perfusjon av 100 µM amilorid, en inhibitor av Na+ reabsorpsjon i Ringer i løsningen; et klorfritt løsning som inneholder amilorid til stasjonen klorid sekresjon og 10 µM isoproterenol i en flammehemmende løsning med amilorid å stimulere syklisk adenosin monofosfat (cAMP)-avhengige klorid konduktans knyttet til CFTR.
Denne teknikken har fordelen av å demonstrere egenskapene elektrofysiologiske to nøkkelkomponenter etablere hydrering av luftveiene overflaten væsken åndedretts epitel, ENaC og CFTR. Derfor er det en nyttig forskningsverktøy for fase 2 og bevis på konseptet studier av agenter som er rettet mot CFTR og ENaC aktivitet for behandling av cystisk fibrose (CF) lungesykdom. Det er også en nøkkel oppfølgingsprosedyre å etablere CFTR dysfunksjon når genetisk testing og svette testing er tvetydig. I motsetning til svette klorid er testen relativt mer tidkrevende og kostbare. Det krever også operatør opplæring og kompetanse for å ta testen effektivt. Inter – og intra – subject variasjon er rapportert i denne teknikken spesielt i unge eller samarbeidsvillig fag. Hjelp med denne bekymringen, er tolkning blitt bedre gjennom en nylig godkjent algoritme.
Det overordnede målet med denne metoden er å måle den nese potensielle forskjellen (OD) som mål å undersøke trans-epitelial ion transport i vivo1. Denne teknikken tillater måling av natrium (Na+) og klor (Cl–) transport. OD brukes som et forskningsverktøy siden 1980, og ble akseptert i 1998 som en diagnostisk prosedyre av cystisk fibrose Foundation skrifter konsensus setning2 og i 2017 i cystisk fibrose Foundation skrifter konsensus diagnostiske retningslinjer 3. faktisk biologiske CFTR dysfunksjon, som er årsaken til CF, er dokumentert av en økt Na+ absorpsjon på apikale membranen og en defekt i Cl– sekret. Denne funksjonelle testen gir fordelen av en ekstra diagnose verktøy når genetikk er ikke-avgjørende i pasienter med ubestemmelig mellomliggende svette test resultater3. Selv om denne informasjonen kan også oppnås ved intestinal gjeldende måling biopsier (ICM), ICM er imidlertid bare tilgjengelig i noen sentre globalt og fremme nødvendig standardisering. OD er mer tilgjengelig i ca 60 globale sentre og mål videre åndedretts epitel som er viktigste sykdommen.
Gitt informasjonen den gir CFTR aktivitet, er det også brukt i proof-of-concept studier å vurdere funksjonelle restaurering av CFTR protein av modulator terapier4,5,6,7, 8. Faktisk data fra studier med CFTR mRNA/gen redigering, CFTR forsterker og corrector terapier, markere vesentlige endringer i Cl– og Na+ transport med terapi6,9 og bekrefter at OD kan være en forståelsesfull endepunktet i kliniske forsøk. Som vi mangler følsom klinisk endepunktene kjøpedyktig merker en subtil endring i klinisk status pasienten på kort sikt, kan det hende at denne prekliniske biomarkør svært informativ. Feltet for CFTR modulator terapier utvider raskt og vi trenger tester i vivo som kan raskt dechiffrere aktive forbindelser før du går til store fase 3 forsøk10.
Fysiologiske begrunnelsen av teknikken er basert på måling av potensielle forskjellen airway epitel i neseboret og underhud batterirommet. Ion kanal aktiviteter blir utforsket ved å måle den stabile maksimale planlagte potensielle forskjellen (PD), sine endringer etter blokkerer ENaC relaterte Na+ absorpsjon og kjøre Cl– sekresjon forskjellige apikale Cl– transportører inkludert CFTR. CFTR dysfunksjon vises av en minimal endring i potensielle forskjellen ved stimulering av Cl– sekresjon gjennom en leir avhengige sti og en økt ENaC mediert Na+ absorpsjon som oppdages av en mer negativ planlagte potensiell forskjell og en forbedret respons på amilorid. Mekanistisk grunnlaget for CF kontra vanlig PD summeres i figur 1.
Figur 1: Sammendrag figur Ion kanal aktivitet. (A) Ion aktivitet i luftveiene epitel demonstrere balansert ENaC og CFTR i vanlig fag og (B) tap av CFTR aktivitet som resulterer i økt ENaC mediert natrium transport og redusert CFTR avhengige komponenter transport. ENaC: epithelial natrium kanal, Na+: natrium, CFTR: cystisk fibrose transmembrane regulator, CL–: klorid, mV: millivolt, PD: potensielle forskjell, min: minutt/s Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Denne testen viser imidlertid en viss grad av variasjon både gjentatte målinger i samme pasient og hos pasienter med samme genotype. Dette er av største betydning for å lette tolkingen av endringer etter modulator behandling. Dessuten mangler vi fortsatt validert terskler forskjellsbehandle CF og friske. Dette kan være delvis på grunn av forskjellene mellom tilgjengeligheten av klinisk fasiliteter og teknikker ansatt. Derfor pågår en betydelig internasjonal innsats rettet mot standardisering av testen. Både av oss CFF-TDN (cystisk fibrose Foundation-Therapeutics utvikling nettverk) og ECFS-CTN (europeisk cystisk fibrose samfunnet-kliniske forsøk nettverk) opprettet en OD Standard prosedyre (SOP) for bruk i multisenter og forskning forsøk. Dette siste samarbeidet av CTN og TDN har resultert i en kombinert, internasjonale SOP, bringe sammen kompetanse CTN og TDN (2014)11. Dette dokumentet presenterer protokollen og test teknikker for å ansette OD CF diagnose eller etterforsker startet proof-of-concept prøvelser. Hver center implementere teknikken er ansvarlig for søknaden til sin institusjonelle menneskelige forskning etikk for godkjenning.
Figur 2: skjematisk av hele anbefalt OD oppsett. Merk at anbefalte oppsettet vises, inkludert sekvensiell perfusjon pumper og 4-stopp-kuk-serien oppsettet. Bestemte tilkoblinger og eksempler på komponenter vises i SOP. (Diagrammet endret med tillatelse fra Solomon, G.M. brystet, 201013) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Generell eksperimentell flyten er skissert i figur 2, der OD måles mellom utforske broen på epitel overflate og referanse broen plassert i subcutaneous plass, begge koblet til elektroder og en høy impedans voltmeter.
Dette er sikret av 2 forskjellige systemer: det er 2 akseptabel referanse elektrode oppsett: (i) balansert Ag/AgCl elektroder og et elektrokardiogram (ECG) krem-fylt bro koblet til subkutan plassen med liten slitasje eller (ii) mettet calomel Half-Cells og en agar fylt 22 – til 24-gauge nål introdusert subcutaneously. Kontakten til nasal mucosa aktiveres som en dobbel lumen kateter. En lumen er fylt med agar eller ECG fløte og koblet til måle elektroden, den andre lar perfusjon på nese mucosa av de ulike løsningene.
Spissen av utforske slangen plasseres på luftveiene mucosa under den underlegne nasal Concha (Figur 3).
Figur 3: plassering av utforske rør på luftveiene mucosa. (A) ekstern visning viser plassering. (B) Rhinoscopic Vis demonstrere plassering. (C) Diagram som viser anatomiske plasseringen for kateter plassering. PD: potensielle forskjellen
For å studere svaret av PD flere legemidler, brukes superfusion løsninger via den andre lumen av kateter. Det er flere viktige skritt om forberedelse og gjennomføring av OD målinger, som er beskrevet nedenfor i protokollen, fra innledende forberedelse gjennom til dataanalyse.
Etter forberedelse av løsninger og elektroder gir tilstrekkelig kvalitet testing av elektroder og katetre grunnleggende gjennomføringen av testen. Basal målingene gjøres langs underlegen Concha, hvilke innrømmer utvalg av de beste stedet for måling, vanligvis at med mest negative målingen. Deretter bestemme sekvensiell perfusions Na+ (ENaC) og Cl– (CFTR-avhengige) ion flux via en endring i spenningen over nasal epitel.
I vivo, OD gir en unik måling som kan utføres flere ganger på langsgående basis og viser at med gjentatte målinger, lignende langsgående resultater er observert på et group-wise og personlige14, 15. Det er sterke bevis for at OD har utmerket diskriminering gyldigheten for å skille CF fra ikke-CF. 25 studier vist en statistisk signifikant forskjell i Cl– og Na+ ledningsevne mellom pasienter med CF og sunn kontroller10. Mens flere tidligere utviklet indekser demonstrere denne kapasiteten, forventer vi at nye oppdateringer er nødvendig gitt siste standardizations av metode7,8.
Endringer og feilsøking
Denne testen krever flere viktige trinn å sikre nøyaktige målinger. Dette inkluderer elektroder og katetre lukket sløyfe forskyvningen for å sikre at systemet utfører anbefalte standarder. Pasienter må forbli fremdeles og avholde seg fra fra snakker som dette reduserer gjenstander og kateter dislodgement. Dette gjør testen vanskelig i ikke-samarbeidende pasienter og teknikken er bare rapportert i en studie i barn under 6 års alder7.
Inspisert av nese epitel er nødvendig for å sikre at det er ingen skorper eller Slim på epitel, noe som kan påvirke målingene.
Veldig viktig, må det påpekes at plasseringen av plasseringen av kateter er gjenstand for debatt. SOP presenteres her benytter måling under underlegen Concha (det). Plassering av kateter under IT har blitt standardisert og utført i multicenter studier og derfor er dette anbefalte teknikken. Måling under IT utføres med side-hulls kateter, som kan være vanskelig å opprettholde i fast kontakt med nasal mucosa, mens kontakt med løsningene. Andre grupper kan måle PD på nese gulvet, teknisk enklere. Viktigere, vist Vermeulen (2011) at det 2 metoder er sammenlignbare16.
Oppvarmingen av løsningene er fortsatt en del debatt mellom europeiske og amerikanske centers17,18. Det har blitt forfektet at løsninger på 37 ° C i stedet for 22 ° C øker observert totale klorid svaret av ca 25% og isoproterenol-avhengige klorid svaret av ca 95%18. Men øker oppvarming variasjon, som vurdert av de totale klorid svar17større standardavvik. Derfor oppvarming løsninger er en tilleggsfaktor på variasjon, er det anbefales ikke å varme løsninger med mindre nødvendig på studiet basis.
Vi har tidligere sammenlignet begge elektrode teknikker og fant at både AgCl og Calomel elektrode systemer drives tilsvarende på basale og stimulert strømninger i vanlig fag13.
Begrensninger av teknikken
Denne testen er underlagt betydelig innenfor emnet variasjon. Dette skal regnskapsføres i minnediagnostiseringsprogrammet19variasjon av scoring er særlig utbredt i pasienter med ubestemmelig tracings. Faktorer av variasjon er akutt øvre luftveisinfeksjon, omfattende nasal polypper, tidligere sinus kirurgi og CF-relaterte betennelse, som reduserer dens spesifisitet og følsomhet20,10. I tillegg tolkning av tracings kan være forskjellig mellom leserne, men ekspert lesere vise utmerket avtale av kvantitative scoring og interpretability CF og ikke-CF tracings, kontrast med en betydelig variasjon i de tillit av sporing19.
Iboende variasjon versus betydelig terskler
Veldig viktig, fysiologiske variasjon av målingen er betydelig, som illustrert i forskjellige studier10, som CFTR gene terapi prøvelser som vist betydelig variasjon i endringer i klorid totale transport og amilorid varierer21,22. Tverrsnittsstudier evaluering antyder at null Cl– pluss isoproterenol svar over terskelen av-5 -7 mV er cut-off mellom CF og ikke-CF fag10.
Likevel mangler vi klart kunnskap om omfanget av endring av denne parameteren representerer en effektiv CFTR korreksjon i fase II forsøk med sykdom endre terapier. For å vurdere individuell respons, kan gjentatte tester overvåking responsen på en intervensjon være nødvendig å skille betydelige endringer fra iboende variasjon. Veldig viktig, må fremtidige langsiktige studier med sykdom endre narkotika vise at forbedring i CFTR-funksjonen samsvarer med forbedring i klinisk relevante resultater eller surrogat resultater (som forbedring i FEV1) av CF sykdom. Faktisk merket en fersk fase II Ivacaftor studie vist klinisk fordel til tross for en liten forbedring i klorid sekresjon23.
Slike studier vil bidra til å etablere hvis cut-off verdien forbedring i trans-epitelial Cl–konduktans kan være en surrogat parameter for klinisk fordel. Dette er en viktig parameter for guiding utviklingen av CFTR å endre terapier.
Betydning når det gjelder eksisterende metoder: svette Test og Intestinal gjeldende målinger (ICM)
Hos pasienter med ” tvilsom ” cystisk fibrose, som vurdert av en mellomliggende svette Cl– konsentrasjon mellom 30 og 60 mM, OD sammensatt score følger en svært følsom å diagnostisere pasienter ” CF-sannsynlig ” og ” CF-usannsynlig ”10 . Intestinal gjeldende måling (ICM), som gir en ex vivo måling av netto Cl– flukser over endetarms epitel, tillater også fastsettelse av gjenværende CFTR funksjonen med en høy følsomhet, fordi CFTR er svært uttrykt i Denne epitel.
Vurderer modifikasjon av CFTR funksjonen ved CFTR modulatorer, forholdet mellom disse ulike CFTR biomarkør endringene er i dag uklart. Selv om nyere arbeid basert på fastslått Ivacaftor at OD og svette test er korrelert4, det ennå ikke har opprettet hvis en måling i luftveiene er en bedre prediktor for åndedretts resultat enn for eksempel, svette test24 , 25 eller endring i ICM. Videre kan modifikator narkotika også varierer i deres orgel bestemte efficacies. I forhold til OD er det viktig å merke seg at endringer i basale PD og amilorid respons uttrykke Na+ transport, mens endringer i 0 Cl– og isoproterenol svar express Cl– transport. Det er ennå å bli etablert som disse er viktigere for sykdom forbedring.
Fremtidig bruk av denne teknikken
Bruk av denne teknikken er ventet utenfor feltet CF. Siden denne teknikken er unikt egnet for å demonstrere Na+ og Cl– ion kanalen, kan det brukes for å demonstrere dysfunksjon i airways sykdommer som astma26, kronisk bronkitt27, ikke-CF bronkiektasier28 og tilbakevendende pankreatitt29. I tillegg har endringer av denne teknikken vært brukt i lavere luftveiene (LAPD) for å demonstrere nedre luftveier-fokusert CFTR dysfunksjon i kroniske hindrende lunge sykdom (COPD) pasienter med kronisk bronkitt30.
OD gir en følsom i vivo biomarkør av CFTR-funksjonen, som kan brukes for både diagnostisering, og også for proof-of-concept studier å rette CFTR og ENaC stasjon aktivitet i translasjonsforskning. Dette gjør langsgående vurdering av trans-epitelial funksjon og holder løftet som en strategi for personlig medisin skreddersy mest effektive corrector for hver pasient med CF.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av arbeidsgruppen for CFTR funksjonen standardisering leder (kliniske forsøk nettverk, europeiske cystisk fibrose samfunn) og den nasjonale ressurser Center Working Group (Therapeutics Development Network, cystisk fibrose Foundation). Ytterligere støtte ble gitt av CF Foundation (Clancy FY09 til GMS) og NIH (DK072482 SMR og GMS).
KD Scientific infusion pump (or equivalent – such as programmable infusion pumps provided by the institution/hospital) | Fisher Scientific | ||
Powerlab 4/30 | AD Instruments | ||
BMA-200 AC/DC portable bioamplifier | AD Instruments | ||
IS0-Z isolation headstage for BMA-200 | AD Instruments | ||
Windows compatible PC – Minimum requirements of Windows XP or higher | Various | ||
AD Instruments software: GLP Client V6 (Windows) or higher | AD Instruments | ||
ECG electrode (ground for study subject) | Hospital standard | ||
2 mini calomel reference electrodes | Fisher Scientific | 13-620-79 | |
Potassium Chloride KCl, Granular – USP, formula weight 76, qty: 500 gm | Spectrum | ||
Sterile container (such as specimen collection container , or similar) to be used for KCl calomel bath, with holes cut in lid to hold electrodes in place. (If not provided by electrode manufacturer.) | Hospital standard | ||
2 electrodes: Ag/AgCl 8 mm TP electrode | BIOPAC Systems | UNSHLD-EL258 | |
2 Ag/AgCl electrodes, B0194, plug 4 mm | SLE Instruments | ||
Signacreme® Conductive Electrode Cream | Fisher Scientific | Parker Labs ref # 17-05 | |
Skin abrasion device | PROMED Feeling | Ref 374901 | |
Hi Di 541 M, Diamond tipped dental burrs | Ash Instruments | ||
Becton Dickinson PE 50 tubing | Fisher Scientific | 427411 | |
Becton Dickinson PE 90 tubing | Fisher Scientific | 427421 | |
Silastic tubing, 0.062” ID, 0.095” OD | Fisher Scientific | 508-007 | |
Micropore Surgical Tape Paper (25 mm x 9.1 m) | 3M | 1530-1 | |
Marquat double lumen catheter Length: 80 cm; Outer diameter: 2.5 mm; Internal diameter of the channels: 0.8 mm; Distance of the side-holes to the tip: 2 mm. EU label Agreement for NPD: I0202US | Marquat | I0202US | |
1" X 10 yards silk tape | 3M Durapore | 1538-1 | |
IV extension tubing (30", 50/box) | International Limited | IMN30 | |
Three-way stopcock (50/box) | Medex | MX5311L | |
Sterile syringe filters (ANOTOP 25 sterile 50pk; 0.22-micron or smaller filters; or equivalent) | Fisher Scientific | 09-926-7 | |
Becton Dickinson Intramedic Luer stub adapter (20G, for connection to PE90 if using nasal catheter produced at study site) | Fisher Scientific | 427564 | |
Becton Dickinson 23G, 0.75” Vacutainer (“butterfly”) needles (0.6 x 19 mm; 50U/box) (for connection to PE50) if using nasal catheter produced at study site) | Fisher Scientific | 367283 | |
Becton Dickinson Syringe 60 ml without needle Luer-Lok tip (40/Box) | Fisher Scientific | 309653 | |
Becton Dickinson Syringe 10 ml without needle Luer-Lok tip (100/Box | Fisher Scientific | 309604 | |
Single use sterile wipes (per institutional availability) | Hospital standard | ||
70% EtOH (1 pint), Aaper Alcohol and Chemical Co. catalog number NC9274019 (or equivalent) | Fisher Scientific | ||
Corning single use sterile bottle-top filters, 0.22 μm pore size (0.15 – 1.0 litre volumes acceptable) | Fisher Scientific | 430624 | |
Buffer Cert Ph 10.00 (1L Sn04332) – for pH meter calibration | Fisher Scientific | ||
Buffer Cert Ph 4.00 (1L Sn04327) – for pH meter calibration | Fisher Scientific | ||
Buffer Cert Ph 7.00 (500 ml Sn04328) – for pH meter calibration | Fisher Scientific | ||
Disposable underpads (Blue Pads; 23"X36" 150/Box; or equivalent per hospital standard) | SureCare | ||
23G, 0.75” Vacutainer “butterfly” needles (0.6×19 mm; 50U/box) | Becton Dickinson | 367283 | |
Difco Laboratories Agar (Noble 100g 0142-15-2; or equivalent) | Fisher Scientific | ||
Welch Allyn Rhinoscope 71000-C (or equivalent) | Fisher Scientific | ||
Welch Allyn Convertible Handle Battery 72300 (or equivalent) OR Otoscope with battery | Fisher Scientific | ||
Head and chin rest (or equivalent; optional) | Richmond Products, Inc | 629R | |
Static Dissipative Anti-Fatigue Matting (or equivalent) | Fisher Scientific | No. 791 | |
REAGENTS FOR SOLUTIONS MIXED ON SITE | |||
Sodium Chloride, Granular – USP NaCl | Spectrum | Formula Weight: 58; Size: 500 gm | |
Calcium Chloride CaCl2•2H2O – USP | Spectrum | Formula Weight: 147; Size: 500 gm | |
Magnesium Chloride Hexahydrate Crystal, MgCl2•6H2O – USP | Spectrum | Formula Weight: 203; Size: 500 gm | |
Potassium Phosphate Dibasic, Anhydrous, Granular, K2HPO4 – USP | Spectrum | Formula Weight: 174; Size: 500 gm | |
Potassium Phosphate Monobasic Crystals – NF (KH2PO4) | Spectrum | Formula Weight: 136; Size: 500 gm | |
Sodium Gluconate- USP (monosodium salt) | Spectrum | Formula Weight: 218; Size: 500 gm | |
Calcium Gluconate – USP (Anhydrous Powder) | Spectrum | Formula Weight: 430; Size: 500 gm | |
Potassium Gluconate- USP (Anhydrous) | Spectrum | Formula Weight: 234; Size: 500 gm | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate – USP MgSO4•7H2O | Spectrum | Formula Weight: 246; Size: 500 gm | |
Amiloride HCl – USP | Spectrum | Formula Weight: 302; Size: 5gm | |
Adenosine 5’-Triphosphate (ATP) (Disodium salt) | Spectrum | Formula Weight: 551; Size: 5gm | |
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Crystal – USP MgCl2•6H2O | Spectrum | Formula Weight: 203; Size: 500 gm | |
Double-distilled water (ddH2O) | Hospital Pharmacy | Formula Weight: NA; Size: 1 L | |
Isoproterenol HCL Injection – USP 1 mg/5 ml ampule | Hospital Pharmacy | Formula Weight: 248; Size: single use | |
Ringers Injection, USP or Ringers Irrigation | Hospital Pharmacy | Formula Weight: NA; Size: 5 L |