교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석
Summary
혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.
Abstract
부상이 나 염증 부상 또는 조직 손상의 사이트에 따라 백혈구의 채용 최근 수십 년 동안 조사 되 고 백혈구 접착 폭포의 개념에 결과 있다. 그러나, 정확한 분자 메커니즘 백혈구 신규 모집에 참여 하지 아직 완전히 확인 되었습니다. 백혈구 신규 모집의 감염, 염증, 그리고 (자동) 면역 연구 분야에서 중요 한 주제를 유지, 이후 우리 접착의 기본 메커니즘 연구, 드 접착, 간단한 층 플로우 기반 분석 결과 제시 및 정 맥 및 동맥 흐름 정권에서 백혈구의 환생. 생체 외에서 분석 결과 백혈구와 혈관 염증의 다른 모델에서 세포 파트너 간의 상호 작용을 기초 분자 메커니즘 연구를 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜 설명 층 플로우 기반 분석 결과 사용 하 여 병렬 흐름 챔버는 거꾸로 단계 대조 현미경 카메라에 연결 된 백혈구 내 피 세포 및 혈소판, 시각 다음 기록 될 수 있는 상호 작용을 공부 하 오프 라인 분석. 내 피 세포, 혈소판, 또는 백혈구 억제제 또는이 프로세스 동안 특정 분자의 역할을 결정 하는 항 체와 pretreated 될 수 있습니다. 전단 조건, 즉 동맥 또는 정 맥 전단 응력, 점도 perfused 액체의 유량과 채널의 높이 의해 쉽게 적응 될 수 있다.
Introduction
부상, 염증, 또는 감염, 백혈구 신속 하 게 응답에 병원 체 또는 손상-관련 된 분자 패턴 (PAMPs, DAMPs)는 활성화 상태로 변경 하 고 혈 류 염증과 조직 손상의 사이트로 이동 합니다. 백혈구의 능력을 그들의 세포질이 고 분자 환경 상호 작용 하는 그들의 올바른 기능에 필수적 면역 세포, 백혈구 접착 결핍증1등 유전 질환에 의해 강조입니다. 백혈구 접착은 지난 수 십년 동안 강렬한 수 사의 대상이 되고있다 그리고 이것은 초기 1990 년대2,3백혈구 접착 폭포의 개념 귀착되. 백혈구 접착 일으키는 혈관 표면 롤오버 셀 피에 백혈구의 selectin-중재 캡처로 시작 됩니다. 이 압 연 백혈구를 endothelium 바인딩된 철새 신호, 예를 들면, 발산, integrins의 활성화를 유도 대 한 검색을 수 있습니다. 그 후, 활성화 integrins 회사 백혈구 체포 결과 내 피 ligands 바인딩 중재. 백혈구 수 있습니다 이후 크롤링 및 확산, 내 피 단층을 관통 하 고 기본 조직으로 transmigrating 하기 전에 extravasate를 준비 합니다. 정식 백혈구 캐스케이드의 기본 개념은 그것의 소개부터 크게 불변에 남아 있었다, 몇몇 중간 단계 추가4. 그럼에도 불구 하 고, 정확한 분자 메커니즘 및 백혈구 신규 모집에서 포함 된 많은 선수의 역할을가지고 하지 명확히 지금까지, 그리고 백혈구 신규 모집의 감염, 염증, 그리고 (자동-) 면역 분야에서 중요 한 주제에 남아 있다 연구입니다.
예를 들어 동맥 경화 같은 혈관 염증 성 질병, 중 혈관 벽 드라이브 패 개발에 백혈구 신규 모집 증가. 불안정 한 동맥 경 화성 플 라크 파열 수, 혈소판 및 응고 시스템의 대규모 활성화 하 고 그 후 선박5의 폐색을 선도 합니다. 이 심근 경색 이나 뇌졸중 등 심각한 심장 혈관 결과 발생할 수 있습니다. 또한, 백혈구 및 혈소판 (예를 들어, 매트릭스 구성 요소와 부드러운 노출된 혈관 벽 내부에의 상호 작용의 수많은 연결 예: 관상 동맥의 stenting 후 그것으로 내 피 노출 발생 임상, 근육 세포)와 혈소판 혈관 상해 취재와 백혈구의. 이러한 상호 작용은 monocyte 혈소판 상호 작용 neointima 형성6,7드라이브 수 있습니다 질병의 추가 개발을 위한 중요 합니다. 또한, 혈소판-백혈구 상호 작용 백혈구 integrin 맥-1 (αMβ2)에 의해 중재 및 혈소판 GPIbα 최근 쥐8혈전 증의 새로운 드라이버 확인 되었습니다.
연구, 그리고 고립 된 매트릭스 분자의 광범위 한 스펙트럼, 불멸 하 게 세포 백혈구와 혈관 근원의 라인에 대 한 백혈구 및 혈소판의 원천으로 인간과 동물성 혈액의 넓은 가용성을 감안할 때, 그것은 백혈구를 시뮬레이션 가능 설정, 특별히 설계 된 흐름 관류 챔버를 사용 하 여 실험실에서 흐름에서의 상호 작용 많은 변종 접착 관류 챔버 진공 기반에서 지난 수 십년 동안 설계 되었습니다. 모든 이체는 공통점이 움직이지 부분 (예를 들어, 교양된 혈관 세포 또는 매트릭스 단백질)으로 더 큰 누출 방지 챔버를 움직이지 부분에 체액의 관류를 사용 하는 미리 정의 된 채널을 갖춘 조립. 또한, 성형 기술 진보 실리 카 폴리머9기반 맞춤 솔루션의 개발을 사용할 수 있습니다. 점도 perfused 액체의 유량과 채널의 높이 주로 흐름 관류 장치10의 전단 응력 특성을 결정합니다. 이 문서에서는, 우리는 생체 외에서 접착의 기본 메커니즘 연구, 드 접착, 방법 및 정 맥 및 동맥 흐름 정권에서 백혈구의 환생 제시. 여기에 제시 된 방법의 장점은 그들은 일반적인 카메라 연결 된 형광 현미경을 사용 하 여 수행할 수 있습니다 하 고 높은 기술 능력을 보유 하는 경험을 필요 하지 않습니다. 생체 외에서 시험 (예를 들어, 추가 억제제 또는 항 체를 차단 하 여), 여러 가지 방법으로 조작할 수 있습니다 따라서 혈관 염증의 다른 모델에 적용 그리고 접착의 조사 단백질 기능을 허용 또는 특정 화합물의 평가입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 생체 외에서 분석 결과 혈관 염증, 동안 백혈구 신규 모집의 기본 메커니즘을 조사 하는 간단한 방법 이지만 지적을 몇 가지 중요 한 포인트는. 이 분석 결과 성공적으로 수행 하기 위한 첫 번째 요구 사항은 백혈구는 그대로 고 confluent 혈관 또는 혈소판 단층의 살포 이다. 이 사전 코팅 콜라겐 유형 표면의 난에 의해 얻을 수 있습니다. 일반적으로, 주요 혈관 세포를 작업할 때 그것은 부?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 박사 마틴 M. 슈미트와 선 Fraemohs 감사합니다. 이 작품 (ZonMW VIDI 016.126.358, 혈액 수혈 연구 (LSBR Nr. 1638) Landsteiner 재단 및 도이치 가운데 (SFB1123/A2) R.R.K.에 게 수 여 과학적인 연구를 위한 네덜란드 기초에 의해 지원 되었다
Materials
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump e.g. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL syringe | Becton Dickinson | 300137 | |
| Silicone tubing | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagen Type I, rat tail | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP – 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES buffer solution 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water for injection | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human Monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 with Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood |
Riferimenti
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