Ex Vivo Инфекции половых слизистой лимфоидной ткани человека и женщин с вирусом иммунодефицита человека 1 и Histoculture
Summary
Инфекция тканях человека с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) ex vivo обеспечивает ценный 3D модель патогенеза вирусов. Здесь мы описываем протокол для обработки и заразить пробах тканей человека миндалин и женских половых mucosae с ВИЧ-1 и поддерживать их в культуре в интерфейсе жидкости воздух.
Abstract
Histocultures позволяют изучать межклеточных взаимодействий в тканях человека, и они могут быть использованы для модели взаимодействия хост возбудитель контролируемых лабораторных условиях. Ex vivo инфекции человека тканей с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), среди других вирусов, успешно используется для расследования ранних патогенеза заболеваний, а также платформу для тестирования эффективности и токсичности противовирусных препаратов. В настоящем протоколе мы объясним, как обрабатывать и заразить эксплантов ткани ВИЧ-1 от человека миндалин и шейки матки mucosae и поддерживать их в культуре на вершине желатин губки на интерфейсе жидкости воздуха около двух недель. Этот параметр-поляризованных культуры увеличивает доступ к питательных веществ в питательной среды и кислорода, хотя прогрессирующая потеря целостности тканей и функциональной архитектуры остается основным ограничением. Этот метод позволяет мониторинга репликации ВИЧ-1 и патогенез, используя несколько методов, в том числе immunoassays, ПЦР и проточной цитометрии. Значение физиологическое изменчивость между донорами ткани, а также между эксплантов из разных областей же образца, может существенно повлиять на результаты экспериментов. Для обеспечения воспроизводимости результатов, важно использовать достаточное количество эксплантов, технические реплицирует и доноров соответствием контроля условий для нормализации результаты экспериментального лечения при компиляции данных из нескольких экспериментов (т.е. ., проведенные с помощью ткани от различных доноров) для статистического анализа.
Introduction
Монотипические Би мерного клеточных культур, здесь упоминаемые как обычных, не учитывают пространственная и функциональная связь между большим разнообразием типов клеток, которые составляют ткани и органы. Этот аспект имеет первостепенное значение для экспериментальных моделях болезней, как вмешательство в гомеостатических межклеточных взаимодействий является движущим фактором всех патологий. Ткани эксплантов предлагают преимущества для моделирования здоровья и болезни среди людей, поскольку они сохраняют cytoarchitecture и многие важные аспекты функциональных органов, как они находятся в естественных условиях, хотя за ограниченное количество времени1. Например после ex vivo вызов с антигенами напомнить, например, дифтерии анатоксином или столбняка, миндалин ткани реагирует с энергичной производства антиген специфические антитела2. Как и любой другой ex vivo модели, histoculture имеет свои собственные ограничения: изменчивость между донорами, ткань поляризации, выживание ограничены ткани и сложности в мониторинге клетки за пределы глубины confocal микроскопии1. Тем не менее эксплантов тканей человека остаются модель выбора для изучения гомеостаза и патогенных иммунологические процессы в организме человека, в том числе хост возбудитель взаимодействий и потенциальных терапевтических вмешательств3.
Критические события патогенеза ВИЧ-1, имели место в тканях. Инфицирования слизистой оболочки половых органов приходится большинство всех ВИЧ-1 передачи события во всем мире4. Лимфоидной ткани является основной сайт репликации вируса во время острой инфекции и гаваней значительный пул латентно инфицированных клеток5, и их сохранение представляет собой основное препятствие для достижения лечения6. Культура и ex vivo вызов человека лимфоидных и слизистых тканей обеспечивают ряд преимуществ перед обычными системами на основе изолированных клеток для изучения ВИЧ-1. Например клетки ткани резидент может поддерживать инфекции ВИЧ-1 в отсутствие внешних активации, в отличие от мононуклеаров периферической крови1. Использование эксплантов лимфоидной ткани позволило лучше понять некоторые ключевые механизмы, лежащие в основе CD4 T клеток истощениет.е., прохожий эффект7, который является отличительной чертой острой инфекции. Сохранение структуры как B клеток фолликулов в лимфоидной ткани8 и эпителия в женских половых слизистой эксплантов9 предлагает уникальную возможность интегрировать пространственные и функциональные особенности ВИЧ-1 инфекции на этих сайтах. Наконец histocultures были успешно использованы модели и исследования герпеса и ВИЧ-1 инфекции10,11, а также для Доклинические испытания антиретровирусных препаратов и multitarget бактерицидные12, 13 , 14 , 15.
Здесь мы описываем подробный протокол для культуры тканей человека эксплантов, полученные из миндалин и слизистых тканей от нижней женских половых органов (матки), охватывающих рассечение тканей в explant вызов с ВИЧ-1-поляризованных способом. Культура ткани эксплантов в жидкость воздуха интерфейс, с помощью губки желатин в качестве поддержки, максимизирует воздействие воздуха кислорода, обеспечивая доступ к питательной среды питательные вещества через Губка капилляров, затягивая тем самым их естественного распада. Наиболее непосредственным способом оценки репликации ВИЧ-1 в нашей системе заключается в том, чтобы измерить количество вируса, выпущенное в среде культуры экспланта со временем иммуноанализа или ПЦР. Инфекции ВИЧ-1 и патогенез (например., CD4 T клеток истощения) могут также быть оценены в ткани эксплантов путем массового извлечения РНК/ДНК и ПЦР, в situ пятнать или единого анализа клеток после переваривания ткани проточной цитометрии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование тканей человека эксплантах для изучения инфекции ВИЧ-1 обеспечивает преимущества над традиционными Би мерной и съедобные экспериментальных систем, таких как главные ячейки или клеточных линий, из-за их высокая способность воспроизводить межклеточных взаимодействий и С…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана гранты от Фонда Blanceflor Бонкомпаньи Ludovisi урожденная Бильдт (http://blanceflor.se/), Фонд шведских врачей против СПИДа (http://www.aidsfond.se/, ref. FOa2014-0006) и Андреа Fondazione e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) к Андреа Introini.
Materials
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
Riferimenti
- Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).
- Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency. Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).
- Dezzutti, C. S. Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success. J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).
- Lederman, M. M., Margolis, L. The lymph node in HIV pathogenesis. Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).
- Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).
- Biancotto, A., et al. HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo. Blood. 111 (2), 699-704 (2008).
- Van Laar, J. M., et al. Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells. Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).
- Introini, A., et al. Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants. PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).
- Grivel, J. C., et al. Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6. Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).
- Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides. Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).
- Lisco, A., et al. Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues. Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).
- Vanpouille, C., et al. A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo. AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).
- Andrei, G., et al. Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication. Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).
- Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides. J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).
- Saba, E., et al. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model. Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).
- Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo. PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).
- Biancotto, A., et al. A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24. J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).
- Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses. Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).
- Keele, B. F., et al. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).
- Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone. Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).
- Ganor, Y., et al. Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates. Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).
- Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5. EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture. Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection. J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).
