Qui, presentiamo un protocollo per mostrare come cella fotoconversione è raggiunto attraverso l'esposizione di UV ad aree specifiche che esprimono la proteina fluorescente, Eos, in animali vivi.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Cella singola fotoconversione in Zebrafish intatto vivente
In questo articolo
Sommario
Abstract
Tessuto animale e vegetale è composto da popolazioni distinte delle cellule. Queste cellule interagiscono nel tempo per costruire e mantenere il tessuto e possono causare la malattia quando perturbato. Gli scienziati hanno sviluppato tecniche intelligente per studiare le caratteristiche e dinamiche naturali di queste cellule all'interno del tessuto intatto esprimendo proteine fluorescenti in sottopopolazioni di cellule. Tuttavia, a volte, gli esperimenti richiedono più selezionato visualizzazione delle cellule all'interno del tessuto, a volte alla maniera unicellulare o popolazione di cellule. Per raggiungere questo obiettivo e visualizzare le singole celle all'interno di una popolazione di cellule, gli scienziati hanno utilizzato fotoconversione unicellulare di proteine fluorescenti. Per illustrare questa tecnica, vi mostriamo qui come dirigere la luce UV a una cella che esprimono Eos di interesse in un intatto, vivono zebrafish. Abbiamo quindi immagine quelle cellule di Eos+ photoconverted 24 h più successivamente per determinare come sono cambiate nel tessuto. Descriviamo due tecniche: singola cella fotoconversione e photoconversions delle popolazioni della cellula. Queste tecniche possono essere utilizzate per visualizzare le interazioni cellula-cellula, cellula-destino e differenziazione e migrazioni delle cellule, che lo rende una tecnica che è applicabile a numerose domande biologiche.
Introduzione
Più celle distinte interagiscono per costruire e mantenere complessi tessuti animali e vegetali. Queste cellule sono spesso intercalati e difficili da distinguere dai vicini a livello di singola cellula senza microscopia ad alta risoluzione che richiedono la fissazione del tessuto. Tuttavia, per capire come questi si formano tessuti, sono mantenuti e diventare malato, è stato fondamentale per indagare come singole cellule all'interno del tessuto interagisce nel corso del tempo. Idealmente, questi esperimenti richiedono l'etichettatura delle singole cellule all'interno di un tessuto in maniera non invasiva, senza l'obbligo di fissazione. Gli scienziati ora hanno svilup....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dall'Università di Notre Dame istituzionali Animal Care e Comitato di uso.
1. preparazione del campione di Zebrafish
- Posizionare un maschio adulto e un adulto femmina Tg (convertibile della proteina) in una camera di accoppiamento per le procedure standard13. In questo manoscritto, utilizzare Tg(sox10:eos) pesce9 a causa di accesso ma altre linee transgeniche con fotoconvertibile della proteina può essere ugualmente usato. Impostare più di una camera nel caso in cui il pesce non posare. Consentire il pesce a rimanere nella camera dur....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Fotoconversione di proteine fluorescenti può essere utilizzato per marcare le cellule distinte all'interno di un tessuto6. Per dimostrare questo, Tg(sox10:eos) pesce9 sono stati utilizzati per esprimere la proteina fotoconvertibile Eos sotto le sequenze regolatrici di sox10. Gli animali di Tg(sox10:eos) 48 hpf erano prima montato e poi ripreso per rilevare qualsiasi fotoconversione aspecifici che può essersi verifi.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
In tessuti complessi, distinti tipi di cellule si organizzano in domini specifici. Recentemente sono state utilizzate tecniche a singole celle etichetta all'interno di queste strutture di grande tessuto1,2,3. Qui dimostriamo due tecniche che possono essere utilizzate allo stesso modo per visualizzare interazioni cellula singola e interazioni di popolazione delle cellule all'interno di tessuti complessi. Il vantaggio della tecnic.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Grazie a Bernard Kulemaka e membri del lab Smith per loro utili commenti e guida di reagente, Sam Connell e Brent Redford di 3i per mettere in campo imaging domande e Deborah Bang, Karen Heed e Kay Stewart per la cura di zebrafish. Questo lavoro è stato supportato dall'Università di Notre Dame, l'Elizabeth e Michael Gallagher Family, la Fondazione Alfred P. Sloan, Centro Zebrafish ricerca presso l'Università di Notre e centro di cellule staminali e medicina rigenerativa presso l'Università di Notre Dame. Tutti gli studi sugli animali sono stati fatti in conformità con la University of Notre Dame IACUC al Dr. Cody Smith.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tg(sox10:eos) animali zebrafishI | pesci sono stati ottenuti e incrociati dall'impianto ittico dell'Università di Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm capsula di Petri | VWR | 25384-302 | |
| Embrione medio | Il terreno embrionale viene prodotto settimanalmente e fornito dalla struttura ittica dell'Università di Notre Dame contenente 5 litri di acqua RO, 30 litri di blu di metilene e 200 ml di brodo di sale. | ||
| 0,8% Punto di fusione basso Agarosio | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm vetro-vetrino fondo capsula di Petri | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| da dissezione ad ago | |||
| 0,002% estere dell'acido 3-aminobenzoico (tricaina) | fluorescente Fluka analytical | A5040-250G | |
| con filtri GFP | Zeiss Axiozoom | ||
| con laser per eccitare set di filtri GFP e RFP | 3i confocale | ||
| a disco rotanteSorgente di luce UV (laser) per fotoconversione | a 405 nm | ||
| Software Slidebook | 3i | ||
| Blu di metilene | Kordon |
Riferimenti
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent prot....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
