小鼠脂肪组织的采集和 RNA 分析处理
Summary
本文的目的是提出一步一步的程序, 收集不同的白脂肪组织的小鼠, 处理脂肪样本和提取 RNA。
Abstract
与其他组织相比, 白脂肪组织的 RNA 和蛋白质含量在诸如实时 PCR 和西方印迹等下游应用中有相当少的成分, 因为它主要含有脂类。RNA 分离从脂肪组织样本也有挑战性, 因为需要额外的步骤, 以避免这些脂质。在这里, 我们提出了一个程序收集三从小鼠解剖不同的白色脂肪组织, 以处理这些样本和执行 RNA 隔离。我们进一步描述了用实时 PCR 技术合成 cDNA 和基因表达实验。本协议允许减少动物的头发和血液对脂肪垫的污染, 以及在组织收集期间不同的脂肪垫之间的交叉污染。它也被优化, 以确保足够数量和质量的 RNA 提取。该协议可广泛应用于任何小鼠模型, 其中脂肪组织样本需要进行常规实验, 如实时 PCR, 但不打算与原发脂肪细胞培养分离。
Introduction
肥胖是一种世界性的流行病, 可能导致并发症, 如2型糖尿病1。饮食诱导的肥胖和转基因动物模型经常用于肥胖及其相关并发症的研究。传统上, 白脂肪组织被称为过剩能量的储存室, 主要由脂质组成, 而褐色脂肪组织将能量转化为热能2,3。脂肪组织是动态的, 并将扩大和收缩取决于许多因素, 如食物摄入量和体力活动。因此, 为了确定促成这些变化的因素, 需要有足够的脂肪组织收集和处理4。
在白色脂肪组织中, 一般认为皮下和内脏脂肪库有不同的性质, 如解剖定位和功能2,5。因此, 为了避免产生冲突的结果或大的变异性, 需要注意避免这些不同的脂肪库之间的交叉污染收集脂肪垫。
此外, 从小鼠白脂肪组织中分离 RNA 或蛋白质有三大挑战。首先, 在肥胖小鼠身上收集脂肪垫并不是一件容易的事, 因为与其他器官如肾脏和心脏6相比, 不同的白色脂肪库的边界并不总是清晰的。其次, 由于脂肪组织的高脂质含量, 在 RNA 或蛋白质分离期间, 一层油脂漂浮在顶部, 防止直接进入样品。第三, 相对于褐色脂肪组织或其他组织, 白脂肪组织有相当低的 RNA 和蛋白质含量, 这是主要的关注, 当使用小鼠, 喂食正常 (N) 饮食和小鼠, 预计将有低脂肪质量 (即KO 模型, 药物治疗, 运动训练等)7,8。
因此, 选择适当的方法分离 RNA 从脂肪组织是关键的。苯酚/氯仿萃取的替代方法是商业套件。它们通常基于最初的苯酚提取步骤, 然后在一列9上进行 RNA 纯化。然而, 这些套件通常更昂贵, 并提供较低的产量样本, 而 RNA 质量可能是可变的, 但更少的时间消耗。然而, 这里所描述的苯酚溶液/氯仿萃取的最大优点之一是可能从单个样本10中分离出 RNA、DNA 和蛋白质。由于小鼠脂肪垫通常是小的, 并给出少量的 RNA 和蛋白质 (特别是在精益小鼠模型), 这些协议最大化的数据, 你可以得到一个小样本。
本文的目的是详细描述一个方法, 以确保足够的样本收集从三小鼠白脂肪组织仓库, 以及数量和质量的 RNA 隔离。通过遵循该协议获得的 RNA 可用于实时 PCR 检测。该协议不是为了 RNA 分离培养的原发脂肪细胞。
Protocol
Representative Results
Discussion
随着 HF 饮食喂养, 肥胖小鼠发现有增加的身体和白脂肪组织重量相比, 喂食一个 N 饮食小鼠。用苯酚溶液提取的 RNA 具有纯度好的样品。瘦素是脂肪主要由脂肪组织产生的, 并且与脂肪质量16呈正相关。正如所料, 瘦素 mRNA 表达增加的肥胖小鼠相伴与他们的脂肪质量。
此方法有几个关键步骤。主要一个是一个白色脂肪组织仓库的污染与另一个, 因为它是已知的?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了加拿大糖尿病患者的支持。
Materials
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
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