마우스 지방 조직 수집 및 RNA 분석에 대 한 처리
Summary
이 문서의 목적은 마우스에서 다른 흰색 adipose 조직 수집, 지방 샘플 처리 RNA를 추출 하는 단계별 절차를 제시 하는 것입니다.
Abstract
다른 조직에 비해, 백색 지방 조직 있으므로 주로 지질 상당히 적은 RNA와 단백질 콘텐츠를 실시간 PCR 및 서쪽 오 점, 같은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 있다. 추가 단계는이 지질을 방지 하는 데 필요한 지방 조직 샘플에서 RNA 절연은 또한 도전 이다. 여기, 우리 3 해부학 다른 흰색 adipose 조직 생쥐, 이러한 샘플을 처리 하 고 RNA 격리 수행에서 수집 하는 절차를 제시. 우리는 더 실시간 PCR를 사용 하 여 cDNA 그리고 유전자 식 실험의 합성을 설명 합니다. 이로써 설명된 프로토콜에서 동물의 머리와 지방 패드 교차 오염을 조직 수집 하는 동안 다른 지방 패드 사이 혈액 오염의 감소 수 있습니다. 그것은 또한 적절 한 수량 및 RNA 추출의 품질을 보장 하기 위해 최적화 되었습니다. 이 프로토콜 지방 조직 샘플은 실시간 PCR 등 일상적인 실험에 필요한 모든 마우스 모델에 널리 적용 될 수 있지만 기본 adipocytes 세포 배양에서 격리에 적합 하지 않습니다.
Introduction
비만 타입-2 당뇨병1등 합병증으로 이어질 수 있는 전 세계적으로 유행 하는. 다이어트 유발 된 비만 유전자 변형 동물 모델에 비만 관련 된 합병증의 연구 자주 사용 됩니다. 전통적으로, 백색 지방 조직 초과 에너지를 위한 저장 격실으로 알려져 있다 이며 주로 지질 구성 된 갈색 지방 조직 열2,3로 에너지를 변환 하는 동안. 지방 조직 동적 확장 하 고 음식 섭취 량과 신체 활동 등 많은 요인에 따라 축소 됩니다. 따라서, 이러한 변화에 기여 요인 결정, 적절 한 지방 조직 수집 및 처리는 필요4.
가운데 흰색 adipose 조직, 그것 일반적으로 피하와 내장 지방 저장소 해부학 지역화 등 다른 속성 있고,2,5기능 허용 됩니다. 따라서, 충돌 하는 결과 또는 큰 변화를 방지 하려면 주의 지방 패드를 수집 하는 때이 다른 지방 저장소 간의 교차 오염을 방지로 이동 해야 합니다.
또한, RNA 또는 단백질 흰 쥐의 지방 조직에서 분리 하는 경우 세 가지 주요 과제 있다. 첫째, 비만 쥐에서 지방 패드를 수집 하지 않습니다 쉬운 일 다른 백색 지방 창 고를 분리 하는 테두리는 항상 명확 하 고, 신장과 심장6등 다른 장기와 달리. 둘째, 지방 조직, RNA 또는 단백질 격리 중의 높은 지질 내용 때문에 지질 층 위에 수레 하 고 샘플에 대 한 직접 액세스를 방지. 셋째, 갈색 지방이 많은 직물, 또는 다른 조직, 반대로 백색 지방 조직 내용이 상당히 낮은 RNA와 단백질 및이 젊은 마우스를 사용할 때 주요 관심사의, 쥐 먹이 정상 (N) 다이어트 이며 쥐 것으로 예상 된다 낮은 뚱뚱한 질량 (즉 코 모델, 치료 약물, 운동 훈련, 등.) 7 , 8.
따라서, 지방 조직에서 RNA를 분리 하는 적절 한 방법을 선택이 중요 합니다. 페 놀/클로 프롬 추출 대체 방법을 상용 키트 있습니다. 그들은 일반적으로 RNA 정화 열9에 따라 초기 페 놀 추출 단계를 기반으로 합니다. 그러나, 그 키트는 일반적으로 더 비싼 및 샘플 낮은 수율의 RNA 품질 변수 수도 주지만 적은 시간이 소요 됩니다. 그러나, 여기에 설명 된 페 놀 솔루션/클로 프롬 추출에 가장 큰 장점 중 하나는 RNA, DNA, 그리고 단일 샘플10에서 단백질 분리의 가능성입니다. 쥐 지방 패드는 일반적으로 작은 있기 때문에 (특히 상체 마우스 모델)에서 RNA와 단백질의 소량을 주고, 이러한 프로토콜 작은 샘플에서 얻을 수 있는 데이터를 극대화 합니다.
이 문서의 목적은 3 쥐 백색 지방 조직 창 고 수량 및 RNA 격리의 품질에서 적절 한 샘플 컬렉션을 확인 하는 방법을 자세히 설명 하기 위해. 이 프로토콜에 따라 얻은 RNA 실시간 PCR 분석 실험을 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜 교양된 기본 adipocytes에서 RNA 격리에 대 한 것이 아닙니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다음 먹이 HF-다이어트, 비만 쥐 몸 및 백색 지방 조직 가중치 N 규정식 먹인 쥐에 비해 증가을 발견 했다. 페 놀 솔루션을 사용 하 여 추출 하는 RNA 좋은 순도와 샘플을 굴복. Leptin은 주로 지방 조직에 의해 생산 하는 adipokine 및 지방 대량16와 긍정적으로 상관 관계 알려져 있다. 예상 했던 대로, leptin mRNA 식 그들의 뚱뚱한 질량을 가진 concomitance에서 비만 생쥐에서 증가 했다.
<p cl…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 당뇨병 캐나다에 의해 지원 되었다.
Materials
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
Riferimenti
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88 (2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots. Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
- Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Res Notes. 6, 472 (2013).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 2009, 574398 (2009).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnol. 14, 94 (2014).
- Tan, P., et al. Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors. Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), 1-5 (2010).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies. Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).
- Dusaulcy, R., et al. Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid. J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).
- Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease. J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).
- Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE). J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
