Musen fettvev samling og bearbeiding for RNA analyse
Summary
Formålet med denne utredningen er å presentere en fremgangsmåte for å samle forskjellige hvite liggende under adipose vev fra mus, behandle fett prøvene og ekstra RNA.
Abstract
Sammenlignet med andre vev, har hvit fettvev et betydelig mindre RNA og protein innhold for nedstrøms programmer som sanntid PCR og Western Blot, siden det meste inneholder lipider. RNA isolasjon fra fettvev prøver er også utfordrende som ekstra trinn kreves for å unngå disse lipider. Her presenterer vi en prosedyre for å samle tre anatomisk forskjellige hvite liggende under adipose vev fra mus, til å behandle disse prøvene RNA isolasjon. Videre beskriver vi syntese av cDNA og gene expression eksperimenter ved hjelp av sanntids PCR. Herved beskrevet protokollen tillater reduksjon av forurensning fra dyrets hår og blod fett pads samt kryssforurensning mellom ulike fett pads under vev samling. Det har også blitt optimalisert for å sikre tilstrekkelig mengde og kvalitet av det utdraget. Denne protokollen kan bli mye brukt til alle musemodell der fettvev prøver kreves for rutinemessig eksperimenter som sanntid PCR, men er ikke ment for isolasjon fra primær adipocytter cellekultur.
Introduction
Fedme er en verdensomspennende epidemien som kan føre til komplikasjoner som type 2 diabetes1. Diett-indusert overvektige og genmodifiserte dyr modeller brukes ofte for forskning i fedme og dens tilknyttede komplikasjoner. Tradisjonelt hvit fettvev er kjent som en lagringen avlukke for overflødig energi og er stort sett består av lipider mens brun fettvev konverterer energi til varme2,3. Fettvev vil er dynamisk og utvide og forminske avhengig av mange faktorer som matinntaket og fysisk aktivitet. Derfor, for å bestemme faktorer som bidrar til disse endringene, tilstrekkelig fettvev informasjonsinnsamling og håndtering er nødvendig4.
Blant hvite liggende under adipose vev, er det generelt akseptert at subkutan og visceral fett depoter har ulike egenskaper som anatomisk lokalisering og fungere2,5. Derfor, for å unngå motstridende resultater eller stor variasjon, oppmerksomhet må tas å unngå kryss-kontaminering mellom disse forskjellige fett depoter når fett pads.
Videre er det tre store utfordringer når isolere RNA eller protein fra mus hvit fettvev. Først er samle fett pads i overvektige mus ikke en lett oppgave som grensen som skiller ulike hvite fett depoter ikke er alltid klart, i motsetning til andre organer som nyrer og hjerte6. Andre, på grunn av det høye lipid innholdet av fettvev, under RNA eller protein isolasjon, et lag av lipider flyter på toppen og hindrer direkte tilgang til prøven. Tredje i stedet for brun fettvev eller andre vev, hvit fettvev har betydelig lavere RNA og protein innhold og dette er av stor bekymring når unge mus, mus matet en normal (N)-diett og mus som er forventet å ha lav fett massene (dvs. KO modeller, behandling med medikamenter, trening trening, etc.) 7 , 8.
Velge den riktige isolere RNA fra fettvev er derfor kritisk. Alternative metoder til fenol/kloroform ekstraksjon er kommersielle kits. De er vanligvis basert på en første fenol utvinning trinn, etterfulgt av RNA rensing på kolonnen9. Men de kits er vanligvis dyrere og gi eksempler på lavere avkastning, mens RNA kvaliteten kan være variabel, men er mindre tidkrevende. Men er en av de største fordelene til fenol løsning/kloroform ekstraksjon beskrevet her muligheten for å isolere RNA og DNA protein fra en enkelt prøve10. Siden mus fett pads er vanligvis små, og gir liten mengde RNA og proteiner (spesielt i mager musen modeller), maksimere disse protokollene dataene kan få ut av et lite utvalg.
Målet med denne utredningen er å beskrive i detalj en metode for å sikre tilstrekkelig prøvetaking fra tre mus hvit fettvev depoter samt kvantitet og kvalitet av RNA isolasjon. RNA oppnås ved å følge denne protokollen kan brukes til å utføre sanntid PCR analyser. Denne protokollen er ikke ment for RNA isolasjon fra kulturperler primære adipocytter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Følgende HF-kosthold fôring, ble overvektige mus funnet å ha økt kroppen og hvite fettvev vekter sammenlignet med mus matet en N diett. RNA utdraget benytter fenol løsning gitt eksempler med god renhet. Leptin er et adipokine hovedsakelig produsert av fettvev, og er kjent for å korrelere positivt med fett masse16. Som forventet, økt leptin mRNA uttrykk i overvektige mus i concomitance med sine fett masse.
Denne metoden har flere viktige trinn. Den store er forure…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Diabetes Canada.
Materials
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
Riferimenti
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88 (2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots. Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
- Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Res Notes. 6, 472 (2013).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 2009, 574398 (2009).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnol. 14, 94 (2014).
- Tan, P., et al. Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors. Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), 1-5 (2010).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies. Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).
- Dusaulcy, R., et al. Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid. J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).
- Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease. J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).
- Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE). J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
