Colección de tejido adiposo ratón y procesamiento para el análisis de ARN
Summary
El objetivo de este trabajo es presentar un procedimiento paso a paso para recoger diferentes tejidos adiposos blancos de ratones, procesar las muestras de grasa y extracto de RNA.
Abstract
En comparación con otros tejidos, tejido adiposo blanco tiene un contenido considerablemente menos RNA y proteína para aplicaciones posteriores como PCR en tiempo real y Western Blot, ya que en su mayoría contiene lípidos. Aislamiento de RNA de las muestras de tejido adiposo también es un reto como pasos adicionales son necesarios para evitar estos lípidos. Aquí, presentamos un procedimiento para recoger tres anatómicamente diferentes blancos los tejidos adiposos de los ratones, para procesar las muestras y realizar aislamiento de RNA. Además describimos la síntesis del cDNA y del gene experimentos de expresión usando PCR en tiempo real. El protocolo aquí descrito permite la reducción de la contaminación de pelo y sangre en almohadillas de grasa, así como la contaminación cruzada entre diferentes cojines gordos durante la recogida de tejido del animal. También se ha optimizado para garantizar la adecuada cantidad y calidad del ARN extraído. Este protocolo puede ser ampliamente aplicada a cualquier modelo de ratón donde las muestras de tejido adiposo son requeridas para experimentos de la rutina como PCR en tiempo real pero no está diseñado para el aislamiento de cultivos celulares de adipocitos primarios.
Introduction
La obesidad es una epidemia en todo el mundo que puede conducir a complicaciones tales como tipo 2 diabetes1. Modelos animales obesos y modificados genéticamente inducida por la dieta se utilizan con frecuencia para la investigación en la obesidad y sus complicaciones asociadas. Tradicionalmente, el tejido adiposo blanco es conocido como un compartimiento de almacenamiento para el exceso de energía y sobre todo se compone de lípidos y tejido adiposo marrón convierte la energía en calor2,3. Tejido adiposo es dinámico y ampliará y encogen dependiendo de muchos factores como el consumo de alimentos y actividad física. Por lo tanto, para determinar los factores que contribuyen a estos cambios, manejo y colección adecuada de tejido adiposo son necesarios4.
Entre los blancos de los tejidos adiposos, está generalmente aceptado que los depósitos de grasa subcutáneos y viscerales tienen diferentes propiedades tales como la localización anatómica y función2,5. En consecuencia, para evitar resultados contradictorios o gran variabilidad, atención debe ser tomado para evitar la contaminación cruzada entre los diferentes depósitos de grasa al recoger cojines gordos.
Por otra parte, hay tres grandes retos cuando aislar RNA o proteína del tejido adiposo de ratones blancos. En primer lugar, recogiendo los cojines gordos en ratones obesos no es tarea fácil como la frontera que separa los diferentes depósitos de grasa blanco no siempre es clara, a diferencia de otros órganos como los riñones y el corazón6. En segundo lugar, debido al contenido alto de lípidos del tejido adiposo, durante el aislamiento de ARN o proteína, una capa de lípidos flota en la parte superior y evita el acceso directo a la muestra. En tercer lugar, a diferencia del tejido adiposo marrón u otros tejidos, tejido adiposo blanco tiene mucho menor contenido de RNA y proteínas y esto es de gran preocupación al usar ratones jóvenes, ratones alimentaron con una dieta normal (N) y ratones que tienen masas de grasa bajo (es decir, KO modelos, tratamiento con fármacos, ejercen entrenamiento, etcetera.) 7 , 8.
Por lo tanto, es fundamental elegir el método adecuado para aislar el ARN del tejido adiposo. Métodos alternativos a la extracción de fenol/cloroformo son kits comerciales. Se basan típicamente en un paso de extracción de fenol inicial, seguido de purificación de RNA en una columna9. Sin embargo, los kits son típicamente más caros y dan muestras de menor rendimiento, mientras que la calidad del RNA puede ser variable pero mucho menos tiempo. Sin embargo, una de las mayores ventajas para la extracción del fenol/cloroformo solución descrita aquí es la posibilidad de aislar RNA, DNA y proteína de una sola muestra de10. Desde cojines gordos ratones son generalmente pequeñas y dan pequeñas cantidades de RNA y proteínas (especialmente en modelos de ratón magro), estos protocolos maximizan los datos que uno puede salir de una pequeña muestra.
El objetivo de este trabajo es describir detalladamente un método para garantizar la obtención adecuada de depósitos de tejido adiposo blanco tres ratones, así como cantidad y calidad de aislamiento de RNA. RNA obtenido siguiendo este protocolo se puede utilizar para realizar análisis PCR en tiempo real. Este protocolo no está diseñado para el aislamiento de RNA de adipocitos cultivados de primarias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Siguiente HF-dieta alimentación, encontraron a ratones obesos tengan más cuerpo y peso del tejido adiposo blanco en comparación con ratones alimentados con una dieta de N. RNA extraído con fenol solución rindió muestras de buena pureza. La leptina es un adipoquinas producidas principalmente por el tejido adiposo y se sabe que correlacionan positivamente con la masa grasa16. Como se esperaba, la expresión de mRNA de leptina aumentó en ratones obesos en concomitancia con su masa grasa.
<…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por Canadá de Diabetes.
Materials
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
Riferimenti
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88 (2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots. Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
- Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Res Notes. 6, 472 (2013).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 2009, 574398 (2009).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnol. 14, 94 (2014).
- Tan, P., et al. Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors. Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), 1-5 (2010).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies. Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).
- Dusaulcy, R., et al. Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid. J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).
- Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease. J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).
- Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE). J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
