In Vitro og In Vivo tilgange til at bestemme Intestinal epitelcelle permeabilitet
Summary
To metoder er præsenteret her for at bestemme intestinal barriere funktion. En epitelial meter (volt/ohm) bruges til målinger af transepithelial elektrisk modstand af kulturperler epitheler direkte i vævskultur brønde. I mus bruges metoden FITC-dextran sonde til at bestemme intestinal permeabilitet i vivo.
Abstract
Den intestinale barriere beskytter mod sygdomsfremkaldende mikroorganisme og mikrobielle toksin. Dens funktion er reguleret af stram vejkryds permeabilitet og epitelcelle integritet, og forstyrrelse af tarmens barriere funktion bidrager til udviklingen af gastrointestinale og systemiske sygdomme. To enkle metoder er beskrevet her til at måle permeabilitet af intestinale epitel. In vitro, Caco-2BBe celler er belagt i vævskultur brønde som en éncellelag og transepithelial elektrisk modstand (TER) kan måles ved en epitel (volt/ohm) meter. Denne metode er overbevisende på grund af sin brugervenlig betjening og repeterbarhed. In vivo mus er gavaged med 4 kDa fluorescein isothiocyanat (FITC)-dextran og FITC-dextran koncentrationer er målt i indsamlede serumprøver fra mus til at bestemme den epitel permeabilitet. Mundtlige sonde giver en nøjagtig dosis, og derfor er den foretrukne metode til at måle intestinal permeabilitet i vivo. Taget sammen, disse to metoder kan måle permeabilitet af den intestinale epitel in vitro og i vivo, og dermed bruges til at studere sammenhængen mellem sygdomme og barriere funktion.
Introduction
Tarm epitelceller er ikke kun ansvarlig for absorptionen af næringsstoffer, men også udgør en væsentlig hindring for forsvare mod patogene mikroorganismer og mikrobielle toksiner. Denne intestinal barriere funktion reguleres af stram vejkryds permeabilitet og epitelcelle integritet1,2,3, og dysfunktion af epitel barriere funktion er forbundet med inflammatoriske tarm disease (IBD). Perijunctional actomyosin ring (Mobilkommunikationstjenester) ligger inden for den celle, der er nært sammenhængende med de stramme kryds. Sammentrækning af Mobilkommunikationstjenester, som er reguleret af myosin lys kæde (MLC), er afgørende for reguleringen af stram vejkryds permeabilitet4,5,6,7,8, 9,10. Tumornekrosefaktor (TNF) er centralt for intestinal barriere tab af upregulating tarm epitel MLC kinase (MLCK) udtryk og overtalelse occludin internalisering11,12,13.
Ioner som Na+ og Cl– kan krydse paracellular plads ved enten pore eller lækage vej14. I en “utæt” epitel afspejler ændringer i TER primært ændrede tight junction permeabilitet. TER måling er et almindeligt anvendte elektrofysiologiske tilgang til at kvantificere tight junction permeabilitet, primært til Na+ og Cl–, baseret på impedans af celle monolag. Forskellige celletyper, herunder tarm epitelceller, pulmonal epitel celler og vaskulære endotel celler, er blevet rapporteret til TER målinger. Fordelene ved denne metode er at TER målinger er ikke-invasive og kan bruges til at overvåge levende celler i realtid. Derudover er TER måleteknik nyttige for lægemiddel toksicitet undersøgelser15.
CaCO-2BBe celler er menneskelige epitelial kolorektal adenocarcinom celler med en struktur og funktion svarende til de differentierede lille tarm epitelceller: for eksempel, disse celler har microvilli og enzymer forbundet med lille tarm børste grænsen. Derfor er kulturperler Caco-2BBe encellelag udnyttet som en in vitro- model for at teste barriere funktion.
I mus er en måde at studere tarm paracellular permeabilitet ved at måle FITC-dextran evne til at krydse fra lumen i blodet. Således kan gavaging FITC-dextran direkte ind i musene og måle fluorescens i blodet vurderes intestinal permeabilitet. Følgende protokol beskriver to enkle metoder til at vurdere intestinale epitel permeabilitet både in vitro- og in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er flere kritiske trin i protokollen. CaCO-2BBe (pensel grænse-udtrykker) celler er altid anvendes til TER måling, valgt fra Caco-2 cellelinie for udtryk for pensel-grænsen proteiner. CaCO-2BBe celler har en villus lydabsorberende fænotype når fuldt differentierede (efter ca 3 ugers kultur efter sammenløbet)17. Det er nødvendigt at undgå forurening under målingen og sterilisere elektrode. Fordi proceduren, der er ikke-sterile, kan der kun udføres målinger for op til 8 h i de fleste …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Jerrold R. Turner, fra Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, for hans generøse hjælp med at gennemføre denne undersøgelse. Dette arbejde er støttet af National Natural Science Foundation i Kina (grant nummer 81470804, 31401229 og 81200620), Natural Science Foundation i Jiangsu provinsen (grant nummer BK20180838, og BK20140319), The forskning Innovation Program for College kandidater af Jiangsu provinsen (grant nummer KYLX16-0116), avanceret forskning projekter af Soochow University (grant nummer SDY2015_06), og Crohns & Colitis Foundation Research Fellowship Award (giver nummer 310801).
Materials
| 22G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Black 96-well plates for fluorescence | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Caco-2BBe cells | ATCC | CRL-2102 | |
| Dextran sulphate sodium | MP Biomedicals | 2160110 | |
| DMED with high glucose and sodium pyruvate | Hyclone | SH30243.01B | |
| Epithelial (Volt/Ohm) Meter | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| Ethanol | Sinopharm ChemicalReagent | 10009218 | |
| Falcon tube (15 mL) | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| Fluorometer | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Modular Tissue Embedding Center | Leica | EG1150H | |
| Serum collection tubes | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 flask | corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Parraffin | Sigma | A6330-1CS | |
| Polycarbonate membranes (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Pressure pump | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Rotary Microtomy | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Xylene | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
Riferimenti
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?. Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).
- Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets. J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).
- Clayburgh, D. R., et al. A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability. J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).
- Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).
- Su, L., et al. Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis. Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).
- Zha, J. M., et al. Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells. Gene. 588, 1-6 (2016).
- He, W. Q., et al. Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1. Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).
- He, W. Q., et al. Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice. Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).
- Li, H. S., et al. Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development. Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).
- Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).
- Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).
- Ye, D., Ma, T. Y. Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity. J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).
- Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability. Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).
- Peterson, M. D., Mooseker, M. S. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2. J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).
- Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).
