In Vitro et In Vivo des approches pour déterminer la perméabilité des cellules épithéliales intestinales
Summary
Deux méthodes sont présentées ici, afin de déterminer la fonction de barrière intestinale. Un compteur épithélial (v/ohm) est utilisé pour la mesure de la résistance transépithéliale des épithéliums cultivées directement dans les puits de culture de tissus. Chez les souris, la méthode de gavage FITC-dextran est utilisée pour déterminer la perméabilité intestinale in vivo.
Abstract
La barrière intestinale défend contre les micro-organismes pathogènes et toxines microbiennes. Sa fonction est réglementée par la perméabilité de la jonction serrée et l’intégrité des cellules épithéliales, et perturbation de la fonction de barrière intestinale contribue à la progression de la maladie gastro-intestinale et systémique. Deux méthodes simples sont décrites ici pour mesurer la perméabilité de l’épithélium intestinal. In vitro, les cellules Caco-2BBe sont plaqués dans les puits de culture de tissu comme une monocouche et résistance électrique transépithéliale (TER) peut être mesurée par un compteur épithéliales (v/ohm). Cette méthode est convaincant en raison de son fonctionnement convivial et la répétabilité. In vivo, souris sont gavés avec 4 kDa isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran et les concentrations de FITC-dextran sont mesurées dans des échantillons de sérum prélevés chez des souris pour déterminer la perméabilité épithéliale. Gavage oral apporte une dose précise et par conséquent il est préférable de mesurer la perméabilité intestinale in vivo. Pris ensemble, ces deux méthodes permettant de mesurer la perméabilité de l’épithélium intestinal in vitro et in vivoet donc être utilisées pour étudier le lien entre les maladies et la fonction de barrière.
Introduction
Les cellules épithéliales intestinales ne sont pas seulement responsables de l’absorption des nutriments, mais constituent également un obstacle important pour se défendre contre les micro-organismes pathogènes et des toxines microbiennes. Cette fonction de barrière intestinale est régulée par la perméabilité de la jonction serrée et cellules épithéliales intégrité1,2,3, et le dysfonctionnement de la fonction de barrière épithéliale est associé à inflammatoires de l’intestin maladie (MICI). L’anneau d’actomyosine perijunctional (PAMR) se trouve dans la cellule qui est étroitement accolée à des jonctions serrées. La contraction de la PAMR, qui est régi par la chaîne légère de la myosine (MLC), est cruciale pour le règlement de la jonction serrée perméabilité4,5,6,7,8, 9,10. Facteur de nécrose tumorale (TNF) est au cœur de la perte de la barrière intestinale par cytoprotectrices expression intestinale épithéliale kinase (MLCK) MLC et induisant occludin internalisation11,12,13.
Ions tels que Na+ et Cl– peut traverser l’espace paracellulaire par le pore ou fuite voie14. Dans un épithélium « Baveur », changements de TER reflètent principalement perméabilité altérée de jonction serrée. Mesure de TER est une approche électrophysiologique couramment utilisée pour quantifier la perméabilité de jonction serrée, principalement à Na+ et Cl–, basée sur l’impédance des monocouches de cellules. Types de cellules différentes, y compris les cellules épithéliales intestinales, les cellules épithéliales pulmonaires et les cellules endothéliales vasculaires, ont été signalés pour des mesures de TER. Avantages de cette méthode sont que TER mesures sont non invasif et peuvent être utilisés pour surveiller des cellules vivantes en temps réel. En outre, la technique de mesure de TER est utile pour la drogue toxicité études15.
Caco-2BBe cellules sont des cellules d’adénocarcinome colorectal épithéliales humaines avec une structure et une fonction semblable aux petites cellules épithéliales intestinales différenciées : par exemple, ces cellules ont des microvillosités et enzymes associées à petite brosse intestinale frontière. Par conséquent, cultivées monocouches de Caco-2BBe sont utilisés comme modèle in vitro pour tester la fonction de barrière.
Chez la souris, une façon d’étudier la perméabilité paracellulaire intestinale est en mesurant la capacité du FITC-dextran à traverser de la lumière dans le sang. Ainsi, la perméabilité intestinale peut être évaluée par gavage FITC-dextran directement dans la souris et en mesurant la fluorescence dans le sang. Le protocole suivant décrit deux méthodes simples pour évaluer la perméabilité de l’épithélium intestinal in vitro et in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il y a plusieurs étapes cruciales dans le protocole. Les cellules Caco-2BBe (brosse exprimant frontière) sont toujours utilisés pour la mesure de TER, sélectionnée dans la lignée de cellules Caco-2 pour l’expression des protéines de la bordure en brosse. Les cellules Caco-2BBe ont un phénotype d’absorption de villosités lorsque complètement dissociés (après environ 3 semaines de confluence après culture)17. Il est nécessaire d’éviter toute contamination pendant la mesure et de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le docteur Jerrold R. Turner, de l’hôpital Brigham et des femmes, Harvard Medical School, pour son aide généreuse dans l’achèvement de cette étude. Ce travail est soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéro de licence 81470804, 31401229 et 81200620), le Natural Science Foundation de la Province du Jiangsu (numéro de licence BK20180838 et BK20140319), le programme d’Innovation de recherche des Diplômés de collège de la Province du Jiangsu (numéro de licence KYLX16-0116), Advanced Research projets de Soochow University (numéro de licence SDY2015_06) et maladie de Crohn & Colitis Foundation Research Fellowship Award (octroyer le numéro 310801).
Materials
| 22G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Black 96-well plates for fluorescence | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Caco-2BBe cells | ATCC | CRL-2102 | |
| Dextran sulphate sodium | MP Biomedicals | 2160110 | |
| DMED with high glucose and sodium pyruvate | Hyclone | SH30243.01B | |
| Epithelial (Volt/Ohm) Meter | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| Ethanol | Sinopharm ChemicalReagent | 10009218 | |
| Falcon tube (15 mL) | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| Fluorometer | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Modular Tissue Embedding Center | Leica | EG1150H | |
| Serum collection tubes | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 flask | corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Parraffin | Sigma | A6330-1CS | |
| Polycarbonate membranes (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Pressure pump | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Rotary Microtomy | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Xylene | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
Riferimenti
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