In Vitro e In Vivo approcci per determinare la permeabilità intestinale delle cellule epiteliali
Summary
Qui sono disponibili due metodi per determinare la funzione di barriera intestinale. Un contatore epiteliale (volt/ohm) è utilizzato per la misurazione della resistenza elettrica transepiteliale del epithelia coltivate direttamente in pozzi di coltura del tessuto. Nei topi, il metodo di alimentazione mediante sonda gastrica FITC-Destrano è utilizzato per determinare la permeabilità intestinale in vivo.
Abstract
La barriera intestinale difende contro i microrganismi patogeni e tossine microbiche. La sua funzione è regolata dalla stretta della giunzione permeabilità e l’integrità delle cellule epiteliali, e rottura della funzione di barriera intestinale contribuisce alla progressione di malattia gastrointestinale e sistematica. Due semplici metodi descritti qui per misurare la permeabilità dell’epitelio intestinale. In vitro, le cellule Caco-2BBe sono placcate in pozzi di coltura del tessuto come uno strato monomolecolare e resistenza elettrica transepiteliale (TER) può essere misurato con un misuratore di epiteliale (volt/ohm). Questo metodo è convincente per la sua facilità di utilizzo e ripetibilità. In vivo, i topi sono gavaged con 4 kDa isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano e le concentrazioni di FITC-Destrano sono misurati in campioni di siero raccolti da topi per determinare la permeabilità epiteliale. Alimentazione mediante sonda gastrica orale offre una dose precisa e pertanto è il metodo preferito per misurare la permeabilità intestinale in vivo. Presi insieme, questi due metodi in grado di misurare la permeabilità dell’epitelio intestinale in vitro e in vivoe quindi essere usati per studiare la connessione tra malattie e funzione di barriera.
Introduction
Cellule epiteliali intestinali non sono solo responsabili per l’assorbimento dei nutrienti, ma anche formano una barriera importante per difendere contro microrganismi patogeni e tossine microbiche. Questa funzione di barriera intestinale è regolata da permeabilità stretta della giunzione e delle cellule epiteliali integrità1,2,3, e disfunzione della funzione di barriera epiteliale è associata con infiammatorie intestinali malattia (IBD). L’anello di actomiosina perijunctional (PAMR) si trova all’interno della cellula che è strettamente contigua per giunzioni strette. La contrazione di PAMR, che è regolata dalla catena leggera della miosina (MLC), è cruciale per la regolazione della stretta della giunzione permeabilità4,5,6,7,8, 9,10. Fattore di necrosi tumorale (TNF) è centrale alla perdita della barriera intestinale espressione di chinasi (MLCK) upregulating epiteliale intestinale MLC e inducendo occludina interiorizzazione11,12,13.
Ioni come Na+ e Cl– può attraversare lo spazio paracellulare di poro o perdita via14. In un epitelio “colante”, cambiamenti in TER riflettono principalmente permeabilità alterata stretta della giunzione. Misurazione di TER è un approccio elettrofisiologico comunemente utilizzato per quantificare la permeabilità stretta della giunzione, principalmente a Na+ e Cl–, basato sull’impedenza di monostrati di cellule umane. Tipi di cellule diverse, tra cui le cellule epiteliali intestinali, cellule epiteliali polmonari e le cellule endoteliali vascolari, sono stati segnalati per misurazioni di TER. Vantaggi di questo metodo sono che le misurazioni TER sono non-invasivo e possono essere utilizzate per monitorare le cellule vive in tempo reale. Inoltre, la tecnica di misurazione TER è utile per droga tossicità studi15.
Caco-2BBe cellule sono cellule epiteliali umane dell’adenocarcinoma del colon-retto con una struttura e funzione simili a piccole cellule epiteliali intestinali differenziate: ad esempio, queste cellule hanno microvilli ed enzimi connessi con la piccola spazzola intestinale confine. Di conseguenza, coltivate Caco-2BBe monostrati sono utilizzati come un modello in vitro per verificare la funzione della barriera.
Nei topi, un modo per studiare la permeabilità intestinale paracellulare è misurando la capacità di FITC-dextrano di attraversare dal lume nel sangue. Così, la permeabilità intestinale può essere valutata da gavaging FITC-Destrano direttamente in topi e misurare la fluorescenza all’interno del sangue. Il seguente protocollo descrive due semplici metodi per valutare la permeabilità dell’epitelio intestinale sia in vitro che in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo. Le cellule Caco-2BBe (confine-esprimendo la spazzola) vengono sempre utilizzate per la misurazione di TER, selezionato dalla linea delle cellule Caco-2 per l’espressione delle proteine del spazzola-confine. Le cellule Caco-2BBe hanno un fenotipo assorbente del villo quando completamente differenziato (dopo circa 3 settimane di post-confluenza cultura)17. È necessario per evitare la contaminazione durante la misurazione e per sterilizzare l’elettrod…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il dottor Jerrold R. Turner, da Brigham and Women Hospital, Harvard Medical School, per il suo generoso aiuto nel completare questo studio. Questo lavoro è sostenuto da Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (concessione numero 81470804, 31401229 e 81200620), il Natural Science Foundation di Jiangsu Province (concessione numero BK20180838 e BK20140319), programma di ricerca dell’innovazione per Collegio laureati della provincia di Jiangsu (concessione numero KYLX16-0116), Advanced Research Progetti di Soochow University (concessione numero SDY2015_06) e di Crohn & colite Foundation Research Fellowship Award (grant numero 310801).
Materials
| 22G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Black 96-well plates for fluorescence | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Caco-2BBe cells | ATCC | CRL-2102 | |
| Dextran sulphate sodium | MP Biomedicals | 2160110 | |
| DMED with high glucose and sodium pyruvate | Hyclone | SH30243.01B | |
| Epithelial (Volt/Ohm) Meter | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| Ethanol | Sinopharm ChemicalReagent | 10009218 | |
| Falcon tube (15 mL) | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| Fluorometer | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Modular Tissue Embedding Center | Leica | EG1150H | |
| Serum collection tubes | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 flask | corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Parraffin | Sigma | A6330-1CS | |
| Polycarbonate membranes (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Pressure pump | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Rotary Microtomy | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Xylene | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
Riferimenti
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?. Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).
- Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets. J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).
- Clayburgh, D. R., et al. A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability. J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).
- Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).
- Su, L., et al. Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis. Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).
- Zha, J. M., et al. Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells. Gene. 588, 1-6 (2016).
- He, W. Q., et al. Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1. Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).
- He, W. Q., et al. Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice. Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).
- Li, H. S., et al. Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development. Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).
- Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).
- Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).
- Ye, D., Ma, T. Y. Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity. J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).
- Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability. Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).
- Peterson, M. D., Mooseker, M. S. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2. J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).
- Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).
