腸管上皮細胞の透磁率を決定する体外と体内アプローチ
Summary
2 つのメソッドは、腸管のバリア機能を決定するここで掲載されています。上皮メーター (ボルト/オーム) は、組織培養の井戸に直接培養上皮細胞の上皮電気抵抗の測定に使用されます。マウスで FITC デキストラン強制経口投与メソッドを使用して、体内の腸の透過性を判断します。
Abstract
腸粘膜バリアーを病原性微生物と微生物毒素に対して守る。その機能はタイトな接合部の透過性と上皮細胞の整合性によって調整され、腸管バリア機能の破壊は、消化管と全身性疾患の進行に貢献します。2 つの単純な方法は小腸上皮の透過性を測定するとおりです。体外、単層として炭酸カルシウム 2BBe 細胞培養ウェルズにメッキパーツをし上皮電気抵抗 (テル) は上皮 (ボルト/オーム) 計で測定できます。このメソッドは、そのユーザーフレンドリーな操作性と再現性のため説得力が。生体内で、マウスが 4 kDa かに (FITC) と gavaged-デキストランと FITC デキストラン濃度上皮の透過性を決定するためのマウスから収集された血清検体で測定されます。経口は、正確な用量を提供します、生体内で腸の透磁率を測定する方法です。一緒に取られて、これらの 2 つの方法腸上皮体外と体内の透水性を測定することができます、したがって病気とバリア機能間の接続を調査する使用します。
Introduction
腸管上皮細胞のみ、栄養素の吸収に責任がないが、また、病原性微生物や微生物毒素に対して守るために重要な障壁を形成します。この腸管バリア機能はタイトな接合部の透過性と上皮細胞の整合性1,2,3、によって調整され上皮バリア機能の機能不全、炎症性腸に関連付けられて病気 (IBD)。Perijunctional アクトミオシン リング (PAMR) タイトな接合に密接に隣接セルの中にあります。ミオシン軽鎖 (MLC) によって規制されている PAMR の収縮はタイト結合透磁率4,5,6,7、8の規則のために重要です 9,10。腫瘍壊死因子 (TNF) 骨折腸上皮 MLC キナーゼ (軽) 式、オクルディン内面11,12,13を誘導する腸の壁損失の中心です。
+の Na および Cl–などのイオンは、孔またはリーク経路14傍細胞領域を越えることができます。「漏れやすい」上皮におけるテル変化主に透磁率変化のタイトな接合を反映します。テルの測定は、タイトな接合部の透過、+の Na および Cl–、主に細胞膜のインピー ダンスに基づくを定量化する一般的な電気生理学的アプローチです。腸管上皮細胞、肺の上皮細胞と血管内皮細胞を含む多様な細胞型は、テル測定の報告されています。この方法の利点は、テルの測定が、非侵襲的、リアルタイムで生きているセルの監視に使用することができることです。さらに、テルの測定技術、薬剤毒性研究15に適しています。
カコ 2BBe 細胞は、構造と機能分化の小さい腸上皮細胞に似たひと上皮大腸腺癌細胞: たとえば、これらの細胞がある微絨毛と小さい腸ブラシに関連する酵素境界線。したがって、培養炭酸カルシウム 2BBe 単分子膜がバリア機能をテストするための in vitroモデルとして利用されています。
マウス腸管傍細胞透過性を勉強する 1 つの方法は、FITC デキストランの内腔から血液に入り込む能力を測定することによってです。したがって、腸の透過性は gavaging デキストラン投与によりマウスと血液内の蛍光測定に直接によって評価されます。次のプロトコル記述する腸上皮の透過性を評価するために 2 つの単純なメソッドの in vitroとin vivoの両方。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルのいくつかの重要な手順があります。カコ 2BBe (ブラシの境界線-表現) 細胞は常にブラシの縁の蛋白質の表現のため炭酸カルシウム 2 細胞ラインから選択したテル測定用します。カコ 2BBe 細胞膜絨毛の吸収性表現型があるとき (文化後合流点の約 3 週間) 後十分に区別される17。測定時の汚染を避けるために、電極を滅菌する必要があります。プロシージャが非滅菌…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ジェロルド ・ r ・ ターナーの博士、Brigham および女性の病院、ハーバード大学医学部からは、本研究を完了するために彼の寛大な助けを感謝いたします。この作品に支えられて (許可番号 81470804、31401229、および 81200620) 中国の国家自然科学基金、自然科学財団の江蘇省 (許可番号 BK20180838、および BK20140319)、研究開発、イノベーション プログラム江蘇省の大学の卒業生 (許可番号 KYLX16-0116)、東呉大学の研究プロジェクトの高度な (許可番号 SDY2015_06)、クローン ・大腸炎財団研究奨励賞 (許可番号 310801)。
Materials
| 22G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Black 96-well plates for fluorescence | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Caco-2BBe cells | ATCC | CRL-2102 | |
| Dextran sulphate sodium | MP Biomedicals | 2160110 | |
| DMED with high glucose and sodium pyruvate | Hyclone | SH30243.01B | |
| Epithelial (Volt/Ohm) Meter | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| Ethanol | Sinopharm ChemicalReagent | 10009218 | |
| Falcon tube (15 mL) | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| Fluorometer | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Modular Tissue Embedding Center | Leica | EG1150H | |
| Serum collection tubes | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 flask | corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Parraffin | Sigma | A6330-1CS | |
| Polycarbonate membranes (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Pressure pump | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Rotary Microtomy | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Xylene | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
Riferimenti
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