In Vitro og i Vivo tilnærminger til å bestemme Intestinal tarmepitelet permeabilitet
Summary
To metoder presenteres her for å finne intestinal barriere-funksjonen. En epithelial meter (volt/ohm) brukes for målinger av transepithelial motstand av kultivert epithelia direkte i vev kultur brønner. I mus brukes FITC-dekstran gavage metoden til å bestemme intestinal permeabilitet i vivo.
Abstract
Intestinal barriere beskytter mot sykdomsfremkallende microorganism og mikrobiell gift. Dens funksjon er regulert av tett krysset permeabilitet og epithelial celle integritet og forstyrrelse av funksjonen intestinal barriere bidrar til utviklingen av mage og systemisk sykdom. To enkle metoder er beskrevet her for å måle permeabilitet av intestinal epitel. In vitro, Caco-2BBe celler er belagt i vev kultur brønner som en monolayer og transepithelial motstand (TER) kan måles ved en epiteliale (volt/ohm) meter. Denne metoden er overbevisende grunn av sin bruker-vennlig operasjon og repeterbarhet. I vivo, mus er gavaged med 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dekstran og FITC-dekstran-konsentrasjoner er målt i samlet serumprøver fra mus til å bestemme epithelial permeabilitet. Muntlige gavage gir en nøyaktig dose, og derfor er den foretrukne metoden å måle intestinal permeabilitet i vivo. Sammen disse to metodene kan måle permeabilitet av intestinal epitel i vitro og i vivo, og derfor brukes til å studere sammenhengen mellom sykdommer og barriere-funksjonen.
Introduction
Intestinal epitelceller er ikke bare ansvarlig for absorpsjon av næringsstoffer, men også danne en viktig barriere for å forsvare seg mot sykdomsfremkallende mikroorganismer og mikrobiell giftstoffer. Intestinal barriere funksjonen er regulert av tett krysset permeabilitet og epithelial celle integritet1,2,3, og dysfunksjon av funksjonen epithelial barriere er forbundet med inflammatorisk tarm sykdom (IBD). Perijunctional actomyosin ringen (PAMR) ligger i cellen som er tett siden de trange knutepunktene. Sammentrekning av PAMR, som reguleres av myosin lys kjeden (MLC), er avgjørende for regulering av tett krysset permeabilitet4,5,6,7,8, 9,10. Tumor nekrose faktor (TNF) er sentralt for intestinal barriere tap upregulating intestinal epithelial MLC kinase (MLCK) uttrykk og inducing occludin internalisering11,12,13.
Ioner som Na+ og Cl– kan krysse paracellular plassen med enten pore eller lekkasje veien14. I en “lekk” epitel gjenspeiler endringer i TER primært endret tett krysset permeabilitet. TER måling er en brukte elektrofysiologiske tilnærming å kvantifisere tett krysset permeabilitet, primært til Na+ og Cl–, basert på impedans på celle monolayers. Ulike celletyper, inkludert intestinal epitelceller, lunge epitelceller og vaskulær endotelceller, er rapportert for TER målinger. Fordelene med denne metoden er at TER målinger er ikke-invasiv og kan brukes til å overvåke lever celler i sanntid. I tillegg er TER måleverdien teknikken nyttig for narkotika toksisitet studier15.
Caco-2BBe celler er menneskelig epithelial colorectal adenocarcinoma celler med struktur og funksjon som ligner på differensiert liten intestinal epitelceller: disse cellene har for eksempel microvilli og enzymer assosiert med liten intestinal børste grensen. Derfor benyttes kulturperler Caco-2BBe monolayers som en i vitro modell for testing barriere-funksjonen.
I mus er en måte å studere intestinal paracellular permeabilitet ved å måle evne til FITC-dekstran å krysse fra lumen i blodet. Dermed kan intestinal permeabilitet vurderes av gavaging FITC-dekstran direkte til mus og måle fluorescens i blodet. Følgende protokollen beskriver to enkle metoder for å vurdere intestinal epitel permeabilitet både i vitro og i vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er flere viktige skritt i protokollen. Caco-2BBe (pensel grensen-uttrykke) celler brukes alltid for TER måling, valgt fra Caco-2 cellen linje for uttrykk for brush-grensen proteiner. Caco-2BBe celler har en villus absorberende fenotypen når fullt differensiert (etter ca 3 uker kultur etter samløpet)17. Er det nødvendig å unngå forurensning under målingen, og å sterilisere elektroden. Prosedyren er ikke-steril, kan målinger bare utføres for opptil 8 timer i de fleste tilfeller. Under …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Jerrold R. Turner, fra Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, for hans sjenerøs hjelp i å fullføre denne studien. Dette arbeidet er støttet av National Natural Science Foundation i Kina (bevilgning nummer 81470804, 31401229 og 81200620), Natural Science Foundation av Jiangsu provinsen (bevilgning nummer BK20180838 og BK20140319), The forskningsprogram innovasjon for College nyutdannede i Jiangsu provinsen (bevilgning nummer KYLX16-0116), avansert forskning prosjekter av Soochow University (bevilgning nummer SDY2015_06), Crohns og kolitt Foundation forskning Fellowship Award (gi nummer 310801).
Materials
| 22G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Black 96-well plates for fluorescence | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Caco-2BBe cells | ATCC | CRL-2102 | |
| Dextran sulphate sodium | MP Biomedicals | 2160110 | |
| DMED with high glucose and sodium pyruvate | Hyclone | SH30243.01B | |
| Epithelial (Volt/Ohm) Meter | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| Ethanol | Sinopharm ChemicalReagent | 10009218 | |
| Falcon tube (15 mL) | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| Fluorometer | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Modular Tissue Embedding Center | Leica | EG1150H | |
| Serum collection tubes | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 flask | corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Parraffin | Sigma | A6330-1CS | |
| Polycarbonate membranes (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Pressure pump | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Rotary Microtomy | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Xylene | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
Riferimenti
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?. Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).
- Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets. J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).
- Clayburgh, D. R., et al. A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability. J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).
- Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).
- Su, L., et al. Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis. Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).
- Zha, J. M., et al. Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells. Gene. 588, 1-6 (2016).
- He, W. Q., et al. Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1. Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).
- He, W. Q., et al. Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice. Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).
- Li, H. S., et al. Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development. Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).
- Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).
- Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).
- Ye, D., Ma, T. Y. Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity. J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).
- Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability. Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).
- Peterson, M. D., Mooseker, M. S. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2. J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).
- Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).
