In Vitro e In Vivo de abordagens para determinar a permeabilidade da célula epitelial Intestinal
Summary
Aqui são apresentados dois métodos para determinar a função de barreira intestinal. Um medidor epitelial (volts/ohms) é usado para a medição da resistência elétrica transepitelial de epitélios cultivadas diretamente nos poços de cultura de tecidos. Nos ratos, o método de gavage FITC-dextrano é usado para determinar a permeabilidade intestinal na vivo.
Abstract
A barreira intestinal defende contra microorganismos patogênicos e toxinas microbianas. Sua função é regulada pela célula epitelial integridade e permeabilidade da junção apertada, e perturbações da função de barreira intestinal contribuem para a progressão da doença sistêmica e gastrointestinal. Dois métodos simples são descritos aqui para medir a permeabilidade do epitélio intestinal. In vitro, células Caco-2BBe são banhadas em poços de cultura de tecidos como uma monocamada e resistência elétrica transepitelial (TER) pode ser medida por um medidor de epiteliais (volts/ohms). Este método é convincente devido à sua operação user-friendly e repetibilidade. Os ratos in vivo são gavaged com 4 kDa isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano e as concentrações de FITC-dextrano são medidos em amostras de soro coletadas de ratos para determinar a permeabilidade epitelial. Gavagem oral fornece uma dose exata e, portanto, é o método preferido para medir a permeabilidade intestinal na vivo. Tomados em conjunto, estes dois métodos podem medir a permeabilidade do epitélio intestinal em vitro e em vivoe, portanto, ser usados para estudar a conexão entre as doenças e a função de barreira.
Introduction
Células epiteliais intestinais não são apenas responsáveis pela absorção de nutrientes, mas também formam uma barreira importante para a defesa contra microorganismos patogênicos e toxinas microbianas. Esta função de barreira intestinal é regulada pela junção apertada permeabilidade e células epiteliais integridade1,2,3, e disfunção da função de barreira epitelial está associada com inflamação intestinal doença (IBD). O anel de actomyosin de perijunctional (PAMR) encontra-se dentro da célula que é estreitamente contígua às junções apertadas. A contração da PAMR, que é regulada pela cadeia leve da miosina (MLC), é crucial para a regulação da junção apertada permeabilidade4,5,6,7,8, 9,10. Fator de necrose tumoral (TNF) é fundamental para a perda da barreira intestinal por estrogenos intestinal epitelial MLC quinase (houve) expressão e induzir a interiorização occludin11,12,13.
Íons como Cl– e at+ pode cruzar o espaço de paracellular pelos poros ou vazamento via14. Em um “vazamento” epitélio, alterações em TER principalmente refletem permeabilidade alterada junção apertada. Medição de TER é uma abordagem eletrofisiológica comumente usada para quantificar a permeabilidade de junção apertada, principalmente para at+ e Cl–, baseada-se a impedância de monocamadas de células. Tipos de diversas células, incluindo células epiteliais intestinais, células epiteliais pulmonares e vascular em células endoteliais, foram relatados para TER medições. As vantagens desse método são que TER medições são não-invasivo e podem ser usadas para monitorar as células vivas em tempo real. Além disso, a técnica de medição de TER é útil para de estudos de toxicidade de drogas15.
Caco-2BBe são células de adenocarcinoma colorretal epitelial humana com uma estrutura e função semelhante a pequenas células epiteliais intestinais diferenciadas: por exemplo, estas células têm microvilli e enzimas associadas com pequena escova intestinal fronteira. Portanto, monocamadas de Caco-2BBe cultivadas são utilizadas como um modelo in vitro para testar a função de barreira.
Em camundongos, uma forma de estudar a permeabilidade intestinal paracellular é medindo-se a capacidade do FITC-dextran cruzar do lúmen para o sangue. Assim, a permeabilidade intestinal pode ser avaliada por gavaging FITC-dextrano diretamente em ratos e medir a fluorescência dentro o sangue. O seguinte protocolo descreve dois métodos simples para avaliar a permeabilidade do epitélio intestinal tanto in vitro e in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem vários passos críticos no protocolo. Células caco-2BBe (fronteira de escova-expressando) sempre são utilizadas para medição de TER, seleccionada a partir da linhagem de células Caco-2 para expressão de proteínas de escova-fronteira. Caco-2BBe células têm um fenótipo de absorção das vilosidades quando totalmente diferenciadas (após cerca de 3 semanas de pós-confluência cultura)17. É necessário para evitar a contaminação durante a medição e para esterilizar o eletrodo….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o Dr. Jerrold R. Turner, do Hospital Brigham e feminino, Harvard Medical School, por sua generosa ajuda na conclusão deste estudo. Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (número de concessão 81470804, 31401229 e 81200620), a ciência Natural Fundação da província de Jiangsu (número de concessão BK20180838 e BK20140319), o programa de inovação de pesquisa para Graduados faculdade da província de Jiangsu (número de concessão KYLX16-0116), avançada pesquisa projetos de Soochow University (número de concessão SDY2015_06) e Crohn e colite Foundation Research Fellowship Award (conceder número 310801).
Materials
| 22G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Black 96-well plates for fluorescence | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Caco-2BBe cells | ATCC | CRL-2102 | |
| Dextran sulphate sodium | MP Biomedicals | 2160110 | |
| DMED with high glucose and sodium pyruvate | Hyclone | SH30243.01B | |
| Epithelial (Volt/Ohm) Meter | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| Ethanol | Sinopharm ChemicalReagent | 10009218 | |
| Falcon tube (15 mL) | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| Fluorometer | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Modular Tissue Embedding Center | Leica | EG1150H | |
| Serum collection tubes | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 flask | corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Parraffin | Sigma | A6330-1CS | |
| Polycarbonate membranes (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Pressure pump | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Rotary Microtomy | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Xylene | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
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