In Vitro и In Vivo подходы для определения проницаемости кишечной эпителиальных клеток
Summary
Здесь представлены два метода для определения функции, кишечный барьер. Эпителиальный метр (ом/вольт) используется для измерения электрического сопротивления transepithelial культивировали эпителия непосредственно в скважинах культуры ткани. В мышей FITC-декстран затравки метод используется для определения кишечную проницаемость в естественных условиях.
Abstract
Кишечный барьер защищает от патогенных микроорганизмов и микробного токсина. Его функция регулируется жесткой перехода проницаемость и целостности эпителиальных клеток, и нарушение функции кишечника барьер способствует прогрессирование заболевания желудочно-кишечного тракта и системные. Два простых способа описаны здесь для измерения проницаемость кишечного эпителия. В пробирке, Како 2BBe клетки покрыты в культуре ткани скважин как монослоя и transepithelial электрического сопротивления (тер) может быть измерена по счётчикам эпителиальных (ом/вольт). Этот метод является убедительным из-за его удобного операции и повторяемость. В естественных условиях, мышей gavaged с 4 кДа флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-декстран и концентрации FITC-декстран измеряются в пробах сыворотки, собранных мышей для определения эпителиальной проницаемости. Пероральная затравка обеспечивает точную дозу и поэтому является предпочтительным методом для измерения проницаемости кишечника в естественных условиях. Взятые вместе, эти два метода могут измерять проницаемость кишечного эпителия в пробирке и в естественных условияхи таким образом быть использованы для изучения связи между заболеваниями и барьерную функцию.
Introduction
Кишечные эпителиальные клетки отвечают не только за поглощение питательных веществ, но также образуют важный барьер для защиты от патогенных микроорганизмов и токсинов, микроорганизмов. Эта функция кишечный барьер регулируется жесткой перехода проницаемость и эпителиальных клеток целостности1,2,3, и дисфункции эпителиальных барьерной функции ассоциируется с воспалительных кишечника болезнь (IBD). Кольцо actomyosin perijunctional (PAMR) лежит в пределах ячейки, тесно примыкать плотные соединения. Сокращение PAMR, который регулируется лёгкие цепи миозина (док), имеет решающее значение для регулирования туго Джанкшен проницаемость4,5,6,,78, 9,10. Фактор некроза опухоли (ФНО) является центральным элементом кишечный барьер потери по upregulating кишечного эпителия док киназы (MLCK) выражение и вызывая occludin интернализации11,,12–13.
Ионы Na+ и Cl– могут пересекать пространство параклеточный поры или утечки путь14. В «Дырявый» эпителия изменения в Тер главным образом отражают изменены туго Джанкшен проницаемости. Измерение тер представляет собой часто используемые электрофизиологических подход к количественно туго Джанкшен проницаемость, главным образом в+ Na и Cl–, основанный на сопротивление клетки монослои. Типов различных клеток, включая клетки кишечного эпителия, легочной эпителиальных клеток и сосудов эндотелиальных клеток, были зарегистрированы для измерения тер. Преимущества этого метода, что Тер измерения неинвазивные и может быть использован для мониторинга живой клетки в режиме реального времени. Кроме того метод измерения Тер полезен для исследования токсичности препарата15.
Како 2BBe клетки являются клетки человека эпителия кишки аденокарциномы с структурой и функцией похож на дифференцированной малого кишечника эпителиальных клеток: к примеру, эти клетки имеют микроворсинки и ферментов, связанных с щеточкой кишечника границы. Таким образом искусственный монослои Како 2BBe используются как модель в пробирке для тестирования барьерную функцию.
В мышей один из способов изучить проницаемость кишечного параклеточный является путем измерения способности FITC-декстран крест из просвета в кровь. Таким образом Кишечная проницаемость может оцениваться gavaging FITC-декстран непосредственно в мышей и измерения флуоресценции в крови. Следующий протокол описывает два простых методов для оценки проницаемость кишечного эпителия в пробирке и в естественных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть несколько важных шагов в протоколе. Како 2BBe (кисть границы выражая) клетки всегда используются для измерения тер, от линии клеток Caco-2 для выражения кисти границы белков. Како 2BBe клетки имеют ворсинок освоения фенотип когда полностью дифференцированной (примерно через 3 недели посл?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Тернер Джерролд р., от Бригама и женской больнице, Гарвардской медицинской школы, за его щедрую помощь в завершении этого исследования. Эта работа поддерживается Национальный фонд естественных наук Китая (номер гранта, 81470804, 31401229 и 81200620), естественные науки фонд провинции Цзянсу (номер гранта BK20180838 и BK20140319), программа исследований инноваций для Выпускники колледжа провинции Цзянсу (номер KYLX16-0116 Грант), передовых исследовательских проектов Soochow университета (Грант № SDY2015_06) и крона и колит Стипендия фонда научных исследований (Грант номер 310801).
Materials
| 22G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Black 96-well plates for fluorescence | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Caco-2BBe cells | ATCC | CRL-2102 | |
| Dextran sulphate sodium | MP Biomedicals | 2160110 | |
| DMED with high glucose and sodium pyruvate | Hyclone | SH30243.01B | |
| Epithelial (Volt/Ohm) Meter | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| Ethanol | Sinopharm ChemicalReagent | 10009218 | |
| Falcon tube (15 mL) | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| Fluorometer | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Modular Tissue Embedding Center | Leica | EG1150H | |
| Serum collection tubes | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 flask | corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Parraffin | Sigma | A6330-1CS | |
| Polycarbonate membranes (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Pressure pump | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Rotary Microtomy | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Xylene | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
Riferimenti
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?. Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).
- Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets. J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).
- Clayburgh, D. R., et al. A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability. J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).
- Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).
- Su, L., et al. Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis. Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).
- Zha, J. M., et al. Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells. Gene. 588, 1-6 (2016).
- He, W. Q., et al. Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1. Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).
- He, W. Q., et al. Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice. Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).
- Li, H. S., et al. Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development. Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).
- Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).
- Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).
- Ye, D., Ma, T. Y. Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity. J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).
- Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability. Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).
- Peterson, M. D., Mooseker, M. S. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2. J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).
- Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).
