In Vitro e In Vivo métodos para determinar la permeabilidad de la célula epitelial Intestinal
Summary
Aquí se presentan dos métodos para determinar la función de barrera intestinal. Un medidor epitelial (voltios/ohmios) se utiliza para la medición de la resistencia eléctrica transepitelial de epitelio cultivado directamente en los pocillos de cultivo de tejidos. En ratones, el método de sonda de FITC-los dextranos se utiliza para determinar la permeabilidad intestinal en vivo.
Abstract
La barrera intestinal defiende contra microorganismos patógenos y toxinas microbianas. Su función está regulada por permeabilidad ensambladura apretada y la integridad de la célula epitelial, y alteración de la función de barrera intestinal contribuye a la progresión de la enfermedad gastrointestinal y sistémica. Aquí se describen dos métodos simples para medir la permeabilidad del epitelio intestinal. In vitro, las células Caco-2BBe se platean en los pocillos de cultivo de tejidos como una monocapa y resistencia eléctrica transepitelial (TER) puede ser medida por un medidor de epitelial (voltios/ohmios). Este método es convincente debido a su utilización y capacidad de repetición. En vivo, los ratones son gavaged con 4 kDa isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano y las concentraciones de FITC-los dextranos se miden en las muestras de suero recogidas en ratones para determinar la permeabilidad epitelial. Sonda oral proporciona una dosis precisa y por lo tanto es el método preferido para medir la permeabilidad intestinal en vivo. Tomados juntos, estos dos métodos pueden medir la permeabilidad del epitelio intestinal in vitro e in vivoy por lo tanto ser utilizados para estudiar la conexión entre enfermedades y función de la barrera.
Introduction
Células epiteliales intestinales no sólo son responsables de la absorción de nutrientes, pero también forman una barrera importante para defenderse de los microorganismos patógenos y toxinas microbianas. Esta función de barrera intestinal está regulada por la permeabilidad de la ensambladura apretada y célula epitelial integridad1,2,3, y la disfunción de la función de barrera epitelial se asocia con inflamatoria intestinal enfermedad (EII). El anillo de actomyosin de perijunctional (PAMR) se encuentra dentro de la célula que es estrechamente contigua a las ensambladuras apretadas. La contracción de PAMR, regulado por la cadena ligera de miosina (MLC), es crucial para la regulación de la ensambladura apretada permeabilidad4,5,6,7,8, 9,10. Factor de necrosis tumoral (TNF) es central a la pérdida de la barrera intestinal por regular expresión de cinasa (MLCK) MLC epitelial intestinal e inducir occludin internalización11,12,13.
Iones tales como Na+ y Cl– puede cruzar el espacio paracelular por el poro o fuga vía14. En un epitelio “agujereado”, cambios en TER reflejan principalmente la permeabilidad alterada ensambladura apretada. Medición de TER es un enfoque electrofisiológico utilizado para cuantificar la permeabilidad de la ensambladura apretada, sobre todo a Na+ y Cl–, basada en la impedancia de monocapas de células. Tipos de diversas células, incluyendo células epiteliales intestinales, las células epiteliales pulmonares y las células endoteliales vasculares, se han divulgado para mediciones de TER. Ventajas de este método son que las mediciones de TER son no invasivos y pueden utilizarse para supervisar células vivas en tiempo real. Además, la técnica de medición de TER es útil para drogas toxicidad estudios15.
Las células Caco-2BBe son células de adenocarcinoma colorrectal epitelial humano con una estructura y función similar a las células epiteliales intestinales pequeñas diferenciadas: por ejemplo, estas células tienen microvellosidades y enzimas asociadas con pequeño cepillo intestinal frontera. Por lo tanto, monocapas de Caco-2BBe cultivadas se utilizan como modelo para las pruebas de función de la barrera en vitro .
En ratones, una forma de estudio de permeabilidad intestinal paracelular es mediante la medición de la capacidad de FITC-los dextranos para cruzar desde el lumen a la sangre. Por lo tanto, la permeabilidad intestinal puede ser evaluada por gavaging FITC-los dextranos directamente en ratones y medir la fluorescencia dentro de la sangre. El siguiente protocolo describe dos métodos simples para evaluar la permeabilidad del epitelio intestinal in vitro e in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varios pasos críticos en el protocolo. Las células Caco-2BBe (cepillo expresando de frontera) siempre se utilizan para la medición de la TER, seleccionado a partir de la línea celular Caco-2 expresión de proteínas del borde en cepillo. Las células Caco-2BBe tienen un fenotipo de la vellosidad absortiva cuando totalmente diferenciadas (aproximadamente 3 semanas después de la confluencia de cultura)17. Es necesario para evitar la contaminación durante la medición y para esterilizar el …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Jerrold R. Turner, del Hospital Brigham y de mujeres, escuela de medicina de Harvard, por su generosa ayuda en la realización de este estudio. Este trabajo es apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (número de licencia 81470804, 31401229 y 81200620), la Ciencia Natural Fundación de la provincia de Jiangsu (número BK20180838 y BK20140319), el programa de innovación de investigación para Graduados de Colegio de la provincia de Jiangsu (número de concesión KYLX16-0116), avanzado de investigación proyectos de Suchow Universidad (número SDY2015_06) y de Crohn & Colitis Fundación Premio de beca de investigación (concesión número 310801).
Materials
| 22G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Black 96-well plates for fluorescence | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Caco-2BBe cells | ATCC | CRL-2102 | |
| Dextran sulphate sodium | MP Biomedicals | 2160110 | |
| DMED with high glucose and sodium pyruvate | Hyclone | SH30243.01B | |
| Epithelial (Volt/Ohm) Meter | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| Ethanol | Sinopharm ChemicalReagent | 10009218 | |
| Falcon tube (15 mL) | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| Fluorometer | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Modular Tissue Embedding Center | Leica | EG1150H | |
| Serum collection tubes | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 flask | corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Parraffin | Sigma | A6330-1CS | |
| Polycarbonate membranes (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Pressure pump | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Rotary Microtomy | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Xylene | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
Riferimenti
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?. Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).
- Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets. J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).
- Clayburgh, D. R., et al. A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability. J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).
- Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).
- Su, L., et al. Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis. Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).
- Zha, J. M., et al. Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells. Gene. 588, 1-6 (2016).
- He, W. Q., et al. Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1. Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).
- He, W. Q., et al. Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice. Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).
- Li, H. S., et al. Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development. Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).
- Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).
- Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).
- Ye, D., Ma, T. Y. Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity. J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).
- Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability. Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).
- Peterson, M. D., Mooseker, M. S. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2. J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).
- Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).
