Vitro ve In Vivo yaklaşımlar Bağırsak epitel hücre geçirgenliği belirlemek için
Summary
İki yöntem burada bağırsak bariyer fonksiyonunu belirlemek için sunulmuştur. Bir epitel metre (volt/ohm) doku kültürü kuyu içinde doğrudan kültürlü epiteli transepithelial Elektrik direniş ölçümler için kullanılır. Farelerde, FITC dextran sonda ile besleme yöntemi bağırsak geçirgenliği vivobelirlemek için kullanılır.
Abstract
Bağırsak bariyer patojen mikroorganizma ve mikrobiyal toksin karşı savunur. İşlevi sıkı kavşak geçirgenliği ve epitel hücre bütünlük tarafından düzenlenir ve bağırsak bariyer fonksiyonu bozulma gastrointestinal ve sistemik hastalık ilerleme katkıda bulunur. Burada Bağırsak epitel geçirgenliği ölçmek için iki basit yöntem anlatılmaktadır. Vitro, Caco-2BBe hücreleri bir monolayer doku kültürü wells kaplama ve transepithelial elektrik direnci (TER) bir epitel (volt/ohm) metre ile ölçülür. Bu yöntem olan Kullanıcı dostu işlem ve tekrarlanabilirlik nedeniyle ikna edici. İçinde vivo fareler 4 kDa floresein isothiocyanate (FITC) ile gavaged-dextran ve FITC dextran konsantrasyonları epitel geçirgenliği belirlemek için fare üzerinden toplanan serum örneklerinde ölçülen. Oral gavaj doğru bir doz sağlar ve bu nedenle bağırsak geçirgenliği vivoölçmek için tercih edilen yöntemdir. Birlikte ele alındığında, bu iki yöntem bağırsak epitel içinde in vitro ve in vivogeçirgenliği ölçüm yapabilir ve bu nedenle hastalıklar ve bariyer fonksiyonu arasındaki bağlantıyı çalışmaya kullanılması.
Introduction
Bağırsak epitel hücreleri sadece besin emilimi için sorumlu değildir, ama aynı zamanda patojen mikroorganizmaların ve mikrobiyal toksinler karşı savunmak için önemli bir bariyer oluşturmak. Bu bağırsak bariyer fonksiyonu sıkı kavşak geçirgenliği ve epitel hücre bütünlüğü1,2,3tarafından düzenlenir ve epitel bariyer fonksiyonunun disfonksiyon iltihabi bağırsak ile ilişkilidir hastalığı (IBD). Perijunctional actomyosin yüzük (PAMR) sıkı kavşak yakından bitişik hücre içinde yatıyor. Myosin hafif zincir (MLC) tarafından düzenlenir, PAMR daralma sıkı kavşak geçirgenliği4,5,6,7,8düzenlenmesi için önemlidir, 9,10. Tümör nekroz faktör (TNF) bağırsak bariyer kaybı etkinleşmiş Bağırsak epitel MLC kinaz (MICK) ifade ve occludin içselleştirilmesi11,12,13inducing için merkezi bir noktada bulunuyor.
İyonlar Na+ ve Cl– gibi gözenek veya sızıntı yolu14tarafından paracellular alan çapraz. “Sızan” bir epitel içinde TER değişiklikleri öncelikle değişmiş sıkı kavşak geçirgenliği yansıtmak. TER ölçüm hücre monolayers empedans göre sıkı Kavşağı geçirgenliği, Na+ ve–, Cl için öncelikle ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir elektrofizyolojik yaklaşımdır. Farklı hücre tipleri, Bağırsak epitel hücreleri, pulmoner epitel hücreleri ve vasküler endotel hücreleri, gibi TER ölçülerini bildirilmiştir. Bu yöntemin avantajları, TER ölçümleri non-invaziv ve canlı hücreleri gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanılan vardır. Buna ek olarak, TER ölçüm tekniği uyuşturucu toksisite çalışmaları15için yararlıdır.
Caco-2BBe hücreleri insan epitel kolorektal adenokarsinom hücre yapısı ve farklılaştırılmış küçük bağırsak epitel hücrelere benzer işlev vardır: Örneğin, microvilli ve küçük bağırsak fırça ile ilişkili enzimler bu hücreler var sınır. Bu nedenle, kültürlü Caco-2BBe monolayers bariyer fonksiyonu test etmek için bir vitro model olarak kullanılmaktadır.
Farelerde, kana lümen geçmeye FITC dextran yeteneği ölçerek bağırsak paracellular geçirgenliği çalışmaya yollarından biridir. Böylece, bağırsak geçirgenliği gavaging FITC dextran doğrudan içine fare ve kan içinde floresans ölçme tarafından tespit edilebilir. Aşağıdaki iletişim kuralı Bağırsak epitel geçirgenliği değerlendirmek için iki basit yöntem açıklanır vitro ve içinde vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokolünde çeşitli kritik adımlar vardır. Caco-2BBe (fırça sınır-ifade) hücreler her zaman TER ölçüm, Caco-2 hücre kültürünü ifade sınır ötesi fırça proteinlerin için seçildiği için kullanılır. Caco-2BBe hücreleri villus dinsel fenotip var ne zaman tam-Ayrıştırılan (kültür sonrası izdiham yaklaşık 3 hafta sonra)17. Ölçüm sırasında kontaminasyon ve elektrot sterilize etmek için gereklidir. Yordamı non-steril olduğundan, ölçümleri yalnızca en fazl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada tamamlanmasında cömert yardım için Dr Jerrold R. Turner, Brigham ve kadın Hastanesi, Harvard Tıp Okulu, teşekkür ederim. Bu eser desteklenen (grant numarası 81470804, 31401229 ve 81200620) Çin’in ulusal doğal Bilim Vakfı, Doğa Bilimleri Vakfı, Jiangsu Province (grant numarası BK20180838 ve BK20140319), araştırma Innovation programı için Jiangsu Province, üniversite mezunları (grant numarası KYLX16-0116), ileri araştırma projeleri Soochow Üniversitesi (grant sayı SDY2015_06) ve Crohn ve kolit Vakfı Araştırma Bursu Ödülü (sayı 310801 vermek).
Materials
| 22G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Black 96-well plates for fluorescence | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Caco-2BBe cells | ATCC | CRL-2102 | |
| Dextran sulphate sodium | MP Biomedicals | 2160110 | |
| DMED with high glucose and sodium pyruvate | Hyclone | SH30243.01B | |
| Epithelial (Volt/Ohm) Meter | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| Ethanol | Sinopharm ChemicalReagent | 10009218 | |
| Falcon tube (15 mL) | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| Fluorometer | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Modular Tissue Embedding Center | Leica | EG1150H | |
| Serum collection tubes | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 flask | corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Parraffin | Sigma | A6330-1CS | |
| Polycarbonate membranes (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Pressure pump | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Rotary Microtomy | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Xylene | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
Riferimenti
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?. Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).
- Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets. J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).
- Clayburgh, D. R., et al. A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability. J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).
- Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).
- Su, L., et al. Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis. Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).
- Zha, J. M., et al. Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells. Gene. 588, 1-6 (2016).
- He, W. Q., et al. Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1. Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).
- He, W. Q., et al. Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice. Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).
- Li, H. S., et al. Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development. Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).
- Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).
- Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).
- Ye, D., Ma, T. Y. Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity. J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).
- Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability. Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).
- Peterson, M. D., Mooseker, M. S. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2. J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).
- Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).
