Proliferatie en differentiatie van lymfkliertest myeloïde voorloper 32 quinquies/G-CSF-R cellen
Summary
Hier worden gedetailleerde protocollen voor het kweken van de 32 quinquies/G-CSF-R cellijn van lymfkliertest myeloïde voorloper, uitvoeren van virale infecties en het uitvoeren van de proliferatie en differentiatie testen gepresenteerd. Deze cellijn is geschikt voor de studie van myeloïde cel ontwikkeling, en de rol van genen van belang in myeloïde celgroei en neutrofiele differentiatie.
Abstract
Inzicht in de hematopoietische stamcellen en voorlopercellen celbiologie heeft belangrijke implicaties voor regeneratieve geneeskunde en de behandeling van hematologische aandoeningen. Ondanks de meest relevante gegevens die kan worden verkregen met behulp van in vivo modellen of primaire culturen, beperkt de lage overvloed van hematopoietische cellen van de stam en voorlopercellen aanzienlijk de pool van geschikte technieken voor hun onderzoek. Daarom kan het gebruik van cellijnen voldoende productie van biologisch materiaal voor de uitvoering van screenings of testen waarvoor grote cel nummers. Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving, uitlezing en interpretatie van de proliferatie en differentiatie tests die worden gebruikt voor het onderzoek van de processen die betrokken zijn bij myelopoiesis en neutrofiele differentiatie. Deze experimenten gebruikmaken van de 32 quinquies/G-CSF-R cytokine lymfkliertest myeloïde doelcel lijn, die beschikt over de mogelijkheid om te verspreiden in het bijzijn van IL-3 en differentiëren in G-CSF. Wij bieden geoptimaliseerde protocollen voor het afhandelen van 32 quinquies/G-CSF-R cellen en bespreken van valkuilen en nadelen die de beschreven tests en de verwachte resultaten in gevaar kunnen brengen. Daarnaast bevat dit artikel protocollen voor lentivirale en retrovirale productie, titratie en transductie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen. We laten zien dat genetische manipulatie van deze cellen kan worden gebruikt met succes functionele en moleculaire om onderzoek te verrichten, die resultaten verkregen met primaire hematopoietische cellen van de stam en voorlopercellen of in vivo modellen kunnen aanvullen.
Introduction
De hematopoietische stamcellen en voorlopercellen bevolking levert het organisme met een groot bereik van volwassen cellen, met inbegrip van cellen uit de myeloïde geslacht (neutrofiele granulocyten, eosinofielen basofielen en monocyten). Het proces dat de aandrijving van de productie van myeloïde cellen van hematopoietische stamcellen staat bekend als myelopoiesis, en voldoende productie van volwassen myeloïde cellen in reactie op de veranderende eisen is een voorwaarde voor goede coping van het organisme met stress voorwaarden, zoals infecties en bloedverlies. Onvoldoende productie van volwassen myeloïde cellen kan leiden tot onmogelijkheid tot het elimineren van pathogenen, verminderde bloedstolling en andere levensbedreigende omstandigheden1,2. Bovendien, kunnen wijzigingen in myeloïde lineage ontwikkeling ook gepaard gaan met hematologische maligniteiten, zoals acute myeloïde leukemie (AML)3. Wijzigingen in de myelopoiesis kunnen zich voordoen als gevolg van verschillende redenen, zoals gebreken in cel oppervlakte receptoren4, veranderde uitingen van transcriptie factoren5, verminderde signalering trajecten6, mutaties resulterend in vorming / activering van oncogenen7, of inactivering van tumor suppressor genen8.
Verschillende methoden hebben ontwikkeld om te studeren myeloïde ontwikkeling, en beoordelen van het effect van specifieke genetische wijzigingen in dit proces. Gemeenschappelijke benaderingen gebruikt bij het bestuderen van myelopoiesis omvatten primaire cellen en transgene muizen. Al deze modellen toe verwerving van biologisch relevante gegevens, hebben ze bepaalde beperkingen. Het gebruik van primaire cellen ontmoetingen een beperkt aantal cellen en een beperkte periode van cultuur, vernauwing van de mogelijkheden om te veranderen van genexpressie en de daaropvolgende biologische of biochemische analyse. Transgene muizen zijn kostbaar en vereisen een redelijke mate van biologische rechtvaardiging. Bovendien voegt werken met in vivo modellen een mate van complexiteit in het begrip van de rol van een gen van belang in een bepaald proces. Daarom, alternatieve benaderingen te omzeilen deze beperkingen nodig zijn. Cellijnen onbetwistbare voordelen hebben: (1) zij beschikken over onbeperkte proliferatie capaciteit waarmee het genereren van genoeg materiaal voor biochemische en biologische studies, (2) ze zijn gevoelig voor genetische manipulaties (knockdown, knock-out, overexpressie), (3) de kosten relatief laag is, en (4) zij toestaan dat een zekere mate van biologische vereenvoudiging vereist in bepaalde experimentele benaderingen.
De ouderlijke IL-3 (interleukine-3) afhankelijke 32 quinquies cellijn werd in 1983 opgericht door Greenberger en collega’s door infectie van beenmergcellen van C3H/HeJ muizen met vriend lymfkliertest leukemie virus9. Verschillende 32ste klonen werden beschreven in de literatuur: cl-239, cl-310en cl-1011. De 32ste cl-3 cellen bleken te verspreiden in IL-3 en ondergaan neutrofiele differentiatie op een behandeling met granulocyt-kolonie stimulatie factor (G-CSF)10. Integendeel, werden 32ste cl-10 cellen, terwijl zijn afhankelijk van de IL-3, oorspronkelijk niet onderscheiden in reactie op G-CSF behandeling. In 1995 de groep van Dr. Ivo Touw retrovirally getransduceerde 32ste cl-10 cellen met wild type en mutant vormen van G-CSF receptor (G-CSF-R), teneinde functioneel belangrijke delen van deze receptor11. Deze studie resulteerde in de generatie van de 32 quinquies/G-CSF-R-cellen, die ook afhankelijk van IL-3 zijn, maar binnen 6 tot 10 dagen na de vervanging van IL-3 met G-CSF, cellen stoppen om te vermenigvuldigen en onherroepelijk onderscheiden in volwassen neutrofiele granulocyten. Deze eigenschappen maken 32ste cl-3 en 32 quinquies/G-CSF-R cellen vereenvoudigde modellen van lymfkliertest neutrofiele differentiatie die kan worden gedifferentieerd door twee welomschreven groei en differentiatie factoren – IL-3 en G-CSF. Tijdens de laatste decennia hebben meerdere groepen 32 quinquies/G-CSF-R cellen gebruikt om te bestuderen van de rol van bepaalde genen in de proliferatie en differentiatie van myeloïde cellen in cultuur12,13,14,15 , 16, en te bestuderen of G-CSF signalering17,18. Nog belangrijker is, de resultaten verkregen met behulp van deze cellijn gecorreleerd met gegevens die zijn verkregen met primaire cellen en transgene muizen16,19,20,21. Wij zijn bijgevolg van mening dat 32 quinquies/G-CSF-R paneeltechnologie, een wijd gebruikte en reeds lang gevestigde model een waardevolle systeem vormen te bestuderen myeloïde differentiatie die kan worden gebruikt in parallel met andere benaderingen voor het aanpakken van deze vraag.
Hier, gedetailleerde protocollen beschrijven de behandeling van de 32 quinquies/G-CSF-R cellijn, welke uitbreiding van de dekking, differentiatie en evaluatie van de proliferatie en differentiatie van deze cellen wordt gepresenteerd. Gedetailleerde informatie voor genetische modificatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen, hetzij door retrovirale of lentivirale signaaltransductie, evenals de protocollen voor virus titratie zijn verstrekt. Daarnaast vindt u enkele representatieve resultaten waaruit potentiële toepassingen van 32 quinquies/G-CSF-R cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De keuze van een experimenteel model is een van de belangrijkste kwesties in onderzoek. Hoewel primaire dierlijke en menselijke cellen worden verondersteld om de meest biologisch relevante gegevens te produceren, wordt deze modellen ethische bezwaren kunnen betrekken en worden vaak geassocieerd met dure en/of geavanceerde isolatie/kweken van procedures. Primaire cellen in aantallen zijn beperkt en het is moeilijk om genetisch te manipuleren hen. Bovendien, vertegenwoordigen primaire cellen een heterogene populatie bestaa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Prof. Ruud Delwel en Prof. Ivo Touw voor het verstrekken van ons met de 32 quinquies/G-CSF-R cellijn en Prof. Daniel G. Tenen voor het verstrekken van ons met de cellijn van Bosc23. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het subsidie-Agentschap van de Tsjechische Republiek (GACR 15-03796S en GACR 17-02177S) bij MA-J, ondersteuning van het Instituut voor moleculaire genetica van de Tsjechische Academie van Wetenschappen (RVO 68378050) MA-J, een GA UK fellowship (project nr. 341015) van de Karelsuniversiteit in Praag MK, en een fellowship GA UK (project nr. 1278217) van de Karelsuniversiteit in Praag te PD.
Materials
| RPMI 1640 powder medium | Merck, Kenilworth, NJ, USA | T 121-10 | without NaHCO3, with L-glutamine |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 31985-047 | L-Glutamine, Phenol Red |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) | MT35011CV | For differentiation of 32D/G-CSF-R cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells |
| Penicillin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | G1914 | |
| murine IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 213-13 | |
| human G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 300-23 | |
| Polyethylenimine | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | Linear, MW 25,000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| Trypsin | VWR Chemicals, Radnor, PA, USA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | C0775 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | T6146 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | D2650 | |
| May-Grünwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Italy | 10802 |
Riferimenti
- Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
- Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O. Colony-stimulating factors for febrile neutropenia during cancer therapy. N Engl J Med. 368 (12), 1131-1139 (2013).
- Lowenberg, B., Downing, J. R., Burnett, A. Acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 341 (14), 1051-1062 (1999).
- Dong, F., et al. Identification of a nonsense mutation in the granulocyte-colony-stimulating factor receptor in severe congenital neutropenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (10), 4480-4484 (1994).
- Rosenbauer, F., Tenen, D. G. Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with transformation. Nat Rev Immunol. 7 (2), 105-117 (2007).
- Kota, J., Caceres, N., Constantinescu, S. N. Aberrant signal transduction pathways in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 22 (10), 1828-1840 (2008).
- Kvinlaug, B. T., et al. Common and overlapping oncogenic pathways contribute to the evolution of acute myeloid leukemias. Cancer Res. 71 (12), 4117-4129 (2011).
- Krug, U., Ganser, A., Koeffler, H. P. Tumor suppressor genes in normal and malignant hematopoiesis. Oncogene. 21 (21), 3475-3495 (2002).
- Greenberger, J. S., Sakakeeny, M. A., Humphries, R. K., Eaves, C. J., Eckner, R. J. Demonstration of permanent factor-dependent multipotential (erythroid/neutrophil/basophil) hematopoietic progenitor cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (10), 2931-2935 (1983).
- Valtieri, M., et al. Cytokine-dependent granulocytic differentiation. Regulation of proliferative and differentiative responses in a murine progenitor cell line. J Immunol. 138 (11), 3829-3835 (1987).
- Dong, F., et al. Mutations in the gene for the granulocyte colony-stimulating-factor receptor in patients with acute myeloid leukemia preceded by severe congenital neutropenia. N Engl J Med. 333 (8), 487-493 (1995).
- Jorda, M. A., Lowenberg, B., Delwel, R. The peripheral cannabinoid receptor Cb2, a novel oncoprotein, induces a reversible block in neutrophilic differentiation. Blood. 101 (4), 1336-1343 (2003).
- Jorda, M. A., et al. Hematopoietic cells expressing the peripheral cannabinoid receptor migrate in response to the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Blood. 99 (8), 2786-2793 (2002).
- Abbas, S., et al. Integrated genome-wide genotyping and gene expression profiling reveals BCL11B as a putative oncogene in acute myeloid leukemia with 14q32 aberrations. Haematologica. 99 (5), 848-857 (2014).
- Zhuang, D., Qiu, Y., Kogan, S. C., Dong, F. Increased CCAAT enhancer-binding protein epsilon (C/EBPepsilon) expression and premature apoptosis in myeloid cells expressing Gfi-1 N382S mutant associated with severe congenital neutropenia. J Biol Chem. 281 (16), 10745-10751 (2006).
- Zjablovskaja, P., et al. EVI2B is a C/EBPalpha target gene required for granulocytic differentiation and functionality of hematopoietic progenitors. Cell Death Differ. 24 (4), 705-716 (2017).
- Santini, V., et al. The carboxy-terminal region of the granulocyte colony-stimulating factor receptor transduces a phagocytic signal. Blood. 101 (11), 4615-4622 (2003).
- Liu, H., Qiu, Y., Xiao, L., Dong, F. Involvement of protein kinase Cepsilon in the negative regulation of Akt activation stimulated by granulocyte colony-stimulating factor. J Immunol. 176 (4), 2407-2413 (2006).
- Kelly, L. M., et al. FLT3 internal tandem duplication mutations associated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in a murine bone marrow transplant model. Blood. 99 (1), 310-318 (2002).
- Pikman, Y., et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 3 (7), e270 (2006).
- Schwaller, J., et al. Transformation of hematopoietic cell lines to growth-factor independence and induction of a fatal myelo- and lymphoproliferative disease in mice by retrovirally transduced TEL/JAK2 fusion genes. EMBO J. 17 (18), 5321-5333 (1998).
- Drobek, A., et al. PSTPIP2, a Protein Associated with Autoinflammatory Disease, Interacts with Inhibitory Enzymes SHIP1 and Csk. J Immunol. 195 (7), 3416-3426 (2015).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Alberich-Jorda, M., et al. C/EBPgamma deregulation results in differentiation arrest in acute myeloid leukemia. J Clin Invest. 122 (12), 4490-4504 (2012).
- Calabretta, B., Perrotti, D. The biology of CML blast crisis. Blood. 103 (11), 4010-4022 (2004).
- Ren, R. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia. Nat Rev Cancer. 5 (3), 172-183 (2005).
- Schuster, C., et al. The effects of Bcr-Abl on C/EBP transcription-factor regulation and neutrophilic differentiation are reversed by the Abl kinase inhibitor imatinib mesylate. Blood. 101 (2), 655-663 (2003).
- Chang, J. S., et al. High levels of the BCR/ABL oncoprotein are required for the MAPK-hnRNP-E2 dependent suppression of C/EBPalpha-driven myeloid differentiation. Blood. 110 (3), 994-1003 (2007).
- Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
- Jorda, M. A., Rayman, N., Valk, P., De Wee, E., Delwel, R. Identification, characterization, and function of a novel oncogene: the peripheral cannabinoid receptor Cb2. Ann N Y Acad Sci. 996, 10-16 (2003).
- Wurm, A. A., et al. Disruption of the C/EBPalpha-miR-182 balance impairs granulocytic differentiation. Nat Commun. 8 (1), 46 (2017).
- Agliano, A. M., et al. On chromosomal instability: what is the karyotype of your 32D CI3 cell line. Blood. 95 (11), 3636-3637 (2000).
- Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nat Methods. 3 (4), 287-293 (2006).
- Houston, I. B., Huang, K. J., Jennings, S. R., DeKoter, R. P. PU.1 immortalizes hematopoietic progenitors in a GM-CSF-dependent manner. Exp Hematol. 35 (3), 374-384 (2007).
- Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M., Kamps, M. P. Hoxa9 immortalizes a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent promyelocyte capable of biphenotypic differentiation to neutrophils or macrophages, independent of enforced meis expression. Mol Cell Biol. 20 (9), 3274-3285 (2000).
- Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M. P., Kamps, M. P. Nup98-HoxA9 immortalizes myeloid progenitors, enforces expression of Hoxa9, Hoxa7 and Meis1, and alters cytokine-specific responses in a manner similar to that induced by retroviral co-expression of Hoxa9 and Meis1. Oncogene. 21 (27), 4247-4256 (2002).
- Fossati-Jimack, L., et al. Phagocytosis is the main CR3-mediated function affected by the lupus-associated variant of CD11b in human myeloid cells. PLoS One. 8 (2), e57082 (2013).
- Schwable, J., et al. RGS2 is an important target gene of Flt3-ITD mutations in AML and functions in myeloid differentiation and leukemic transformation. Blood. 105 (5), 2107-2114 (2005).
- Worch, J., et al. The serine-threonine kinase MNK1 is post-translationally stabilized by PML-RARalpha and regulates differentiation of hematopoietic cells. Oncogene. 23 (57), 9162-9172 (2004).
- Rowley, J. D. Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature. 243 (5405), 290-293 (1973).
- Stam, K., et al. Evidence of a new chimeric bcr/c-abl mRNA in patients with chronic myelocytic leukemia and the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 313 (23), 1429-1433 (1985).
- Holly, S. P., Larson, M. K., Parise, L. V. The unique N-terminus of R-ras is required for Rac activation and precise regulation of cell migration. Mol Biol Cell. 16 (5), 2458-2469 (2005).
- Pierce, J. H., et al. Macrophage-colony-stimulating factor (CSF-1) induces proliferation, chemotaxis, and reversible monocytic differentiation in myeloid progenitor cells transfected with the human c-fms/CSF-1 receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (15), 5613-5617 (1990).
- Pierce, J. H., et al. Signal transduction through the EGF receptor transfected in IL-3-dependent hematopoietic cells. Science. 239 (4840), 628-631 (1988).
- Oomen, S. P., et al. Somatostatin modulates G-CSF-induced but not interleukin-3-induced proliferative responses in myeloid 32D cells via activation of somatostatin receptor subtype 2. Hematol J. 2 (5), 322-329 (2001).
- Oomen, S. P., et al. Somatostatin is a selective chemoattractant for primitive (CD34(+)) hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol. 30 (2), 116-125 (2002).
- Nogami, A., et al. FLT3-ITD confers resistance to the PI3K/Akt pathway inhibitors by protecting the mTOR/4EBP1/Mcl-1 pathway through STAT5 activation in acute myeloid leukemia. Oncotarget. 6 (11), 9189-9205 (2015).
- Rodel, J. E., Link, D. C. Suppression of apoptosis during cytokine deprivation of 32D cells is not sufficient to induce complete granulocytic differentiation. Blood. 87 (3), 858-864 (1996).
- Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific P210bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (23), 9312-9316 (1988).
