Prolifération et la différenciation des précurseurs myéloïdes Murine 32D/G-CSF-R cellules
Summary
Ici sont présentés les protocoles détaillés pour cultiver la lignée murine précurseurs myéloïdes 32D/G-CSF-R, effectuant des infections virales et effectuer des tests de prolifération et la différenciation. Cette lignée cellulaire convient pour étudier le développement des cellules myéloïdes et le rôle des gènes d’intérêt dans la croissance des cellules myéloïdes et différenciation des neutrophile.
Abstract
Compréhension de la biologie des cellules souches et progénitrices hématopoïétique a des implications importantes pour la médecine régénérative et le traitement des pathologies hématologiques. Malgré les données les plus pertinentes qui peuvent être acquis en utilisant des modèles in vivo ou des cultures primaires, la faible abondance de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques restreint considérablement l’ensemble des techniques appropriées pour leur enquête. Par conséquent, l’utilisation de lignées cellulaires permet une production suffisante de matériel biologique pour l’exécution des examens préalables ou des dosages nécessitant un nombre de grandes cellules. Nous présentons ici une description détaillée, lecture et interprétation des tests de prolifération et la différenciation qui sont utilisées pour l’étude des processus impliqués dans la myelopoiesis et la différenciation des neutrophile. Ces expériences utilisent la ligne de cellule myéloïde murine dépendante de cytokine 32D/G-CSF-R, qui possède la capacité à proliférer en présence de l’IL-3 et se différencier dans le G-CSF. Nous fournissons optimisé des protocoles de traitement des cellules-32D/G-CSF-R et discuter les principaux écueils et les inconvénients qui pourraient compromettre les essais décrits et les résultats escomptés. En outre, cet article contient des protocoles pour la production des gènes et rétrovirale, titrage et transduction des cellules-32D/G-CSF-R. Nous démontrons que la manipulation génétique de ces cellules peut être employée pour réaliser avec succès des études moléculaires et fonctionnelles, qui peuvent compléter les résultats obtenus avec des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques primaires ou des modèles in vivo .
Introduction
La population de souches et progénitrices hématopoïétique fournit à l’organisme avec une grande variété de cellules matures, y compris les cellules de la lignée myéloïde (neutrophiles, éosinophiles, basophiles et monocytes). Le processus qui entraîne la production de cellules myéloïdes de cellules souches hématopoïétiques est connu comme myelopoiesis, et une production adéquate des cellules myéloïdes matures en réponse aux demandes changeantes est une condition sine qua non pour la bonne adaptation de l’organisme au stress conditions, telles que les infections et la perte de sang. Production insuffisante de cellules myéloïdes matures peut conduire à l’impossibilité d’éliminer les agents pathogènes, réduit la coagulation sanguine et autres mortelle conditions1,2. En outre, les modifications dans le développement de la lignée myéloïde peuvent également être associées avec des hémopathies malignes, telles que la leucémie myéloïde aiguë (AML)3. Altérations de myelopoiesis peuvent se produire pour diverses raisons, tels que les défauts dans la cellule récepteurs de surface4, expressions altérées de facteurs de transcription5, impaired signalisation des voies6, mutations entraînant la formation de / activation des oncogènes7ou inactivation de gènes suppresseur tumeur8.
Diverses méthodes ont été développées pour étudier le développement myéloïde et évaluer l’effet des altérations génétiques spécifiques dans ce processus. Des approches communes utilisées pour étudier myelopoiesis impliquent des cellules primaires et les souris transgéniques. Bien que ces modèles permettent l’acquisition des données pertinentes sur le plan biologique, ils ont certaines limites. L’utilisation de cellules primaires rencontre un nombre limité de cellules et une période de restriction de la culture, réduisant les possibilités pour modifier l’expression génétique et analyse biologique ou biochimique. Les souris transgéniques sont coûteuses et exigent un degré raisonnable de justification biologique. En outre, le travail avec des modèles in vivo ajoute un degré de complexité dans la compréhension du rôle d’un gène d’intérêt dans un processus donné. Par conséquent, les approches alternatives pour contourner ces limitations sont nécessaires. Lignées cellulaires ont des avantages incontestables : (1) ils possèdent la capacité de prolifération illimitée qui permet de générer assez de matériel pour les études biochimiques et biologiques, (2) ils sont sensibles aux manipulations génétiques (précipitation, knockout, surexpression), (3) le coût est relativement faible, et (4), elles permettent un degré de simplification biologique requis dans certaines approches expérimentales.
L’IL-3 parental (interleukine-3) dépendantes 32D lignée cellulaire a été créée en 1983 par Greenberger et ses collègues de l’infection des cellules de moelle osseuse de souris C3H/HeJ ami murine leukemia virus9. Plusieurs clones 32D ont été décrits dans la littérature : cl-239cl-310et cl-1011. Les cellules de cl-3 32D apparaissaient à proliférer dans IL-3 et subissent une différenciation neutrophilique après traitement avec des colonies de granulocytes stimulation facteur (G-CSF)10. Au contraire, 32D cl-10 cellules, tout en étant dépendant de l’IL-3, ont été à l’origine ne différenciant en réponse au traitement de G-CSF. En 1995 le groupe du Dr. Ivo Touw transduites retrovirally 32D cl-10 cellules de type sauvage et des formes mutantes de récepteur de G-CSF (G-CSF-R), afin d’identifier les régions fonctionnellement importantes de ce récepteur11. Cette étude a abouti à la génération des cellules-32D/G-CSF-R, qui dépendent de la même façon sur l’IL-3, mais dans les 6 à 10 jours après le remplacement de l’IL-3 avec le G-CSF, les cellules arrêtent pour proliférer et irréversiblement se différencient en neutrophiles matures. Ces propriétés font 32D cl-3 et modèles simplifiés 32D/G-CSF-R cellules murines différenciation neutrophiles qui peut être modulée par deux croissance bien définie et facteurs de différenciation – IL-3 et G-CSF. Durant les dernières décennies plusieurs groupes ont utilisé des cellules-32D/G-CSF-R pour étudier le rôle de certains gènes dans la prolifération et la différenciation des cellules myéloïdes en culture12,13,14,15 , 16et d’étudier le G-CSF, signalisation17,18. Ce qui est important, les résultats obtenus à l’aide de cette lignée cellulaire en corrélation avec les données obtenues avec les cellules primaires et les souris transgéniques16,19,20,21. En conséquence, nous pensons que les cellules 32D/G-CSF-R, étant un modèle largement utilisé et bien établi, représentent un système utile pour étudier la différenciation myéloïde qui peut être utilisée en parallèle avec d’autres approches de répondre à cette question.
Ici, les protocoles détaillés décrivant la manipulation de la lignée cellulaire 32D/G-CSF-R, dont la couverture de l’expansion, la différenciation et l’évaluation de la prolifération et la différenciation de ces cellules est présenté. Information détaillée pour la modification génétique des cellules-32D/G-CSF-R, soit par transduction rétrovirale ou des gènes, ainsi que des protocoles pour le titrage de virus sont prévus. En outre, plusieurs résultats représentatifs qui illustrent les applications potentielles des cellules-32D/G-CSF-R sont fournis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le choix d’un modèle expérimental est l’une des principales questions de recherche. Si des cellules animales et humaines primaires sont censés produire des données plus biologiquement pertinentes, ces modèles peuvent impliquer des préoccupations d’ordre éthique et sont souvent associés avec les procédures d’isolement/culture coûteux et sophistiqués. Les cellules primaires sont limités en nombre et il est difficile de les manipuler génétiquement. Par ailleurs, les cellules primaires représentent une…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Prof. Ruud Delwel et Prof. Ivo Touw pour nous avoir fourni la lignée cellulaire 32D/G-CSF-R et Prof. Daniel G. Tenen pour nous avoir fourni la lignée cellulaire de Bosc23. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Agence de Grant de la République tchèque (GACR 15-03796S et GACR 17-02177S) de la MA-J, le soutien de l’Institut de génétique moléculaire de l’Académie tchèque des Sciences (RVO 68378050) de la MA-J, une bourse de GA UK (projet n° 341015) de l’Université Charles à Prague pour MK et une bourse de GA UK (projet no 1278217) de l’Université Charles à Prague pour PD.
Materials
| RPMI 1640 powder medium | Merck, Kenilworth, NJ, USA | T 121-10 | without NaHCO3, with L-glutamine |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 31985-047 | L-Glutamine, Phenol Red |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) | MT35011CV | For differentiation of 32D/G-CSF-R cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells |
| Penicillin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | G1914 | |
| murine IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 213-13 | |
| human G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 300-23 | |
| Polyethylenimine | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | Linear, MW 25,000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| Trypsin | VWR Chemicals, Radnor, PA, USA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | C0775 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | T6146 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | D2650 | |
| May-Grünwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Italy | 10802 |
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