Proliferazione e differenziazione dei precursori mieloidi murino 32D/G-CSF-R cellule
Summary
Qui vengono presentati protocolli dettagliati per coltura la linea 32D/G-CSF-R cellula precursore mieloide murino, eseguendo le infezioni virali e svolgere le analisi di proliferazione e differenziazione. Questa linea cellulare è adatta per lo studio dello sviluppo delle cellule mieloidi e il ruolo dei geni di interesse in crescita delle cellule mieloidi e differenziazione neutrophilic.
Abstract
Comprensione della biologia delle cellule staminali e progenitrici ematopoietica ha implicazioni importanti per la medicina rigenerativa e il trattamento delle patologie ematologiche. Nonostante i dati più rilevanti che possono essere acquistati utilizzando modelli in vivo o colture primarie, la scarsa abbondanza di cellule staminali e progenitori emopoietici limita considerevolmente la piscina delle tecniche idonee per le loro indagini. Pertanto, l’uso di linee cellulari permette una produzione sufficiente di materiale biologico per l’esecuzione di proiezioni o saggi che richiedono numeri di grandi cellule. Qui presentiamo una descrizione dettagliata, lettura e interpretazione delle analisi di proliferazione e differenziazione che vengono utilizzati per l’indagine dei processi coinvolti nella mielopoiesi e differenziazione neutrophilic. Questi esperimenti utilizzano la linea cellulare mieloide murino dipendente 32D/G-CSF-R citochina, che possiede la capacità di proliferare in presenza di IL-3 e si differenziano in G-CSF. Forniamo ottimizzato protocolli per la gestione delle cellule 32D/G-CSF-R e discutere problemi e inconvenienti che potrebbero compromettere l’analisi descritte e risultati attesi. Questo articolo contiene inoltre protocolli per produzione retrovirale e lentivirale, titolazione e trasduzione di cellule 32D/G-CSF-R. Dimostriamo che la manipolazione genetica di queste cellule può essere impiegato per eseguire con successo gli studi molecolari e funzionali, che possono integrare i risultati ottenuti con le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche primarie o modelli in vivo .
Introduction
La popolazione di staminali e progenitrici ematopoietica fornisce l’organismo con una vasta gamma di cellule mature, tra cui cellule della linea mieloide (neutrofili, eosinofili, basofili e monociti). Il processo che spinge la produzione di cellule mieloidi da cellule staminali ematopoietiche è noto come mielopoiesi, e un’adeguata produzione di cellule mieloidi mature in risposta alle mutevoli esigenze è un prerequisito per il corretto superamento dell’organismo allo stress condizioni, come le infezioni e la perdita di sangue. Insufficiente produzione di cellule mieloidi mature può portare all’incapacità di eliminare gli agenti patogeni, la coagulazione del sangue ridotto e altre pericolose condizioni1,2. Inoltre, alterazioni nello sviluppo della linea mieloide possono anche essere associate con le malignità ematologiche, quali la leucemia mieloide acuta (AML)3. Alterazioni nella mielopoiesi possono verificarsi a causa di vari motivi, come difetti di cellule recettori di superficie4, alterate espressione di fattori di trascrizione5, alterata segnalazione percorsi6, mutazioni conseguente formazione / attivazione di oncogeni7o inattivazione di geni di tumore soppressore8.
Vari metodi sono stati sviluppati per studiare sviluppo mieloide e valutare l’effetto di specifiche alterazioni genetiche in questo processo. Approcci comuni usati per studiare la mielopoiesi coinvolgono cellule primarie e topi transgenici. Se questi modelli consentono l’acquisizione di dati biologicamente rilevanti, essi hanno alcune limitazioni. L’utilizzo di cellule primarie incontra un numero limitato di cellule e un limitato periodo di cultura, restringere le possibilità per alterare l’espressione genica e la successiva analisi biologica o biochimica. Topi transgenici sono costosi e richiedono un grado ragionevole di giustificazione biologica. Inoltre, l’utilizzo di modelli in vivo aggiunge un grado di complessità nella comprensione del ruolo di un gene di interesse in un determinato processo. Pertanto, sono necessari approcci alternativi per aggirare queste limitazioni. Linee cellulari hanno indiscutibili vantaggi: (1) possiedono capacità di proliferazione illimitata che permette di generare abbastanza materiale per studi biochimici e biologici, (2) essi sono suscettibili di manipolazioni genetiche (atterramento, ad eliminazione diretta, sovraespressione), (3) il costo è relativamente basso, e (4) consentono un certo grado di semplificazione biologica necessaria in alcuni approcci sperimentali.
Parentale IL-3 (interleuchina-3) dipendente 32D linea cellulare è stata fondata nel 1983 da Greenberger e colleghi tramite l’infezione di cellule del midollo osseo da topi C3H/HeJ con amico leucemia murina virus9. 32D diversi cloni sono stati descritti in letteratura: cl-239, cl-310e cl-1011. Le cellule di cl-3 32D sono state indicate per proliferare in IL-3 e subire la differenziazione neutrophilic previo trattamento con granulocyte-colonia stimolazione fattore (G-CSF)10. Al contrario, 32D cl-10 cellule, pur essendo dipendente di IL-3, non sono stati originariamente distinguendo in risposta al trattamento di G-CSF. Nel 1995 il gruppo del Dr. Ivo Touw retrovirally trasdotte 32D cl-10 cellule con wild type e forme mutanti del recettore del G-CSF (G-CSF-R), al fine di identificare le aree funzionalmente importanti di questo recettore11. Questo studio ha provocato la generazione delle cellule 32D/G-CSF-R, che sono allo stesso modo dipendenti IL-3, ma entro 6-10 giorni dopo il rimontaggio di IL-3 con G-CSF, le cellule smettono di proliferare e differenziarsi irreversibilmente in neutrofili maturi. Queste proprietà rendono 32D cl-3 e cellule 32D/G-CSF-R modelli semplificati di differenziazione neutrophilic murina che può essere modulata da due ben definito fattori di crescita e differenziazione – IL-3 e G-CSF. Durante gli ultimi decenni più gruppi hanno utilizzato cellule 32D/G-CSF-R per studiare il ruolo dei geni particolari nella proliferazione e differenziazione delle cellule mieloidi in cultura12,13,14,15 , 16e per lo studio di G-CSF, segnalazione17,18. D’importanza, i risultati ottenuti con questa linea cellulare correlate con i dati ottenuti con le cellule primarie e topi transgenici16,19,20,21. Di conseguenza, crediamo che cellule 32D/G-CSF-R, essendo un modello ampiamente usato e ben consolidato, rappresentano un sistema prezioso per lo studio del differenziamento mieloide che può essere utilizzato in parallelo con altri approcci questa domanda.
Qui, protocolli dettagliati che descrivono la gestione della linea cellulare 32D/G-CSF-R, quale espansione di copertura, la differenziazione e valutazione della proliferazione e differenziazione di queste cellule è presentato. Vengono fornite informazioni dettagliate per la modificazione genetica di cellule 32D/G-CSF-R, mediante trasduzione retrovirale o lentivirali, così come protocolli per titolazione del virus. Inoltre, vengono forniti diversi risultati rappresentativi che illustrano le potenziali applicazioni delle cellule 32D/G-CSF-R.
Protocol
Representative Results
Discussion
La scelta di un modello sperimentale è uno dei principali problemi nella ricerca. Anche se le cellule animali e umane primarie sono credute per produrre i dati più biologicamente rilevanti, questi modelli possono comportare preoccupazioni etiche e sono spesso associati a procedure costose e/o sofisticato isolamento/coltura. Cellule primarie sono limitate in numero e si stenta a manipolarle geneticamente. Inoltre, le cellule primarie rappresentano una popolazione eterogenea composta da vari tipi di cellule che possono c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano la Prof. ssa Ruud Delwel e Prof Ivo Touw per averci fornito la linea cellulare 32D/G-CSF-R e Prof. ssa Daniel G. Tenen per averci fornito la linea cellulare Bosc23. Quest’opera è stata sostenuta da sovvenzioni dell’Agenzia Grant della Repubblica Ceca (GACR 15-03796S e GACR 17-02177S) a MA-J, l’Istituto di genetica molecolare dell’Accademia Ceca delle scienze (RVO 68378050) di supporto a MA-J, una borsa di studio UK GA (progetto n. 341015) da Charles University di Praga a MK e una borsa di studio UK GA (progetto n. 1278217) da Charles University di Praga al PD.
Materials
| RPMI 1640 powder medium | Merck, Kenilworth, NJ, USA | T 121-10 | without NaHCO3, with L-glutamine |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15028 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 31985-047 | L-Glutamine, Phenol Red |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA) | MT35011CV | For differentiation of 32D/G-CSF-R cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270 | Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells |
| Penicillin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | S9137 | Streptomycin sulfate salt powder |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | G1914 | |
| murine IL-3 | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 213-13 | |
| human G-CSF | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA | 300-23 | |
| Polyethylenimine | Polyscience, Warrington, PA, USA | 23966 | Linear, MW 25,000 (PEI 25000) |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | H9268 | |
| Trypsin | VWR Chemicals, Radnor, PA, USA | 0458 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | E5134 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | C0775 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | T6146 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA) | D2650 | |
| May-Grünwald Giemsa | DiaPath, Martinengo, BG, Italy | 10802 |
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