Vi beskriver en dramatiskt förbättrad metod för mus kloning med trichostatin A, C-vitamin och avjoniserat bovint serum albumin. Vi visar ett förenklat, reproducerbara protokoll som stöder effektiv utveckling av klonade embryon. Denna metod kan därför bli ett standardiserat förfarande för mus kloning.
Somatisk kärnöverföring (SCNT) ger en unik möjlighet att direkt producera ett klonat djur från en donator-cell, och det kräver användning av skickliga tekniker. Dessutom har effektivitetsvinsterna av kloning förblivit låg sedan den framgångsrika tillverkningen av klonade djur, särskilt möss. Det har gjorts många försök att förbättra kloningens effektivitet och trichostatin A (TSA), en Histon histondeacetylas hämmare, har använts i stor utsträckning att effektivisera av kloning. Här rapporterar vi en dramatiskt förbättrad kloning metod hos möss. Somatisk kärnöverföring metoden innebär användning av Hemagglutinating virus av Japan kuvert (HVJ-E), som möjliggör lätt manipulation. Behandling med två små molekyler, TSA och C-vitamin (VC), med avjoniserat bovint serumalbumin (dBSA), är dessutom mycket effektivt för embryonal utveckling. Detta tillvägagångssätt kräver varken ytterligare injektion eller genetisk manipulation, och således presenterar en enkel, lämplig metod för praktisk användning. Denna metod skulle kunna bli en tekniskt genomförbar strategi för forskare att producera genetiskt modifierade djur från odlade celler. Dessutom kan det vara ett användbart sätt för att rädda utrotningshotade djur via kloning.
Den SCNT-tekniken möjliggör produktion av klonade djur med hjälp av endast en somatisk cell eller en kärna ska överföras till en utan äggcell. Ett av syftena med SCNT tekniken är härledningen av kärnöverföring embryonala stamceller (NT-ESCs) linjer från klonade embryon. 1998, Wakayama et al., rapporterade producerar en framgångsrikt klonade mus som heter Cumulina för första tid1. Sedan dess har kloning av möss Allmänt har undersökts, och många viktiga insikter i nukleära omprogrammering av somatiska kärnor har erhållits. Å andra sidan, denna teknik åtföljs av talrika mikromanipulation steg som är ganska svåra att master, som kräver intensiv utbildning på mer än 3 månader2.
Produktion av klonade möss använda SCNT har utvecklats från den ursprungliga Honolulu metod1, elektrosvets metod3, till metoden cell fusion av Hemagglutinating virus av Japan (HVJ)4. Dock tenderar direkt injektion av en cellkärna genom cytomembrane att negativt påverka äggcellen överlevnad. Elektrosvets är låg i effektivitet, eftersom varje cellmembranet har olika hårdhet, vilket gör det svårt att fastställa en optimal kondition. Hantering av HVJ är arbetskrävande eftersom det kräver särskild utrustning för säkerheten för forskare och försöksdjur. Nyligen för att säkring givare cell och äggcell cytoplasman, har HVJ-E varit används5. HVJ-E har endast möjlighet att säkring membran utan virus proliferativ eller infektiösa förmåga. Genomisk RNAs av HVJ är helt inaktiverade i HVJ-E. Användningen av HVJ-E stöder således enkel hantering av Cellfusion under SCNT.
Flera rapporter har visat att behandling av SCNT embryon med TSA, en Histon histondeacetylas hämmare, betydligt effektiviserar produktionen av levande ungar från mindre än 1% till 6,5%6,7. TSA behandling accelererar omprogrammering via ändra Histon märken i SCNT embryon8. Nyligen, injektion av viss mRNA, Histon lysin demethylase underfamiljen 4 (KDM4), som tar bort Histon H3 lysin 9 (H3K9) trimethylation i SCNT embryon, särskilt vid reprograming-resistenta regioner, har visats öka utvecklingen av klonade mus embryon9. Under tiden, VC, som även fungerar som en Histon modifierare, minskat trimethylation H3K910. Dessutom förbättrar VC embryonal utveckling i svin SCNT10. Det har rapporterats att en injektion av dBSA i SCNT embryon leder till förbättring av embryonal utveckling11.
Vi har tidigare funnit att kombinationen av små molekyler, nämligen TSA och VC, tillsammans med dBSA, dramatiskt förbättrad utveckling av SCNT embryon12. Här, detalj vi tidigare rapporterade SCNT metoden för möss, som representerar mycket effektiv och enkel kloning förfaranden12. Vi beskriver också hanteringen av HVJ-E. Dessa skulle kunna hjälpa många forskare inom utvecklings- och reproduktiva biologi att bevara genetiska resurser eller producera genetiskt modifierade djur genom denna SCNT-metod.
Sammanfattningsvis tyder dessa resultat på att SCNT metod kunde minska tekniska svårigheter, öka effektiviteten av SCNT utan att genetisk modifiering och mRNA tillskott (tabell 1, tabell 2) och säkerställa stabil produktion av klonade embryon. Denna metod gör det möjligt för oss att rekonstruera mer SCNT embryon än konventionella metoder på grund av den bättre överlevnaden och förenklat protokoll. I detta protokoll är ett kritiskt steg Cellfusion. För att framgångsrikt producera klonade möss, är det viktigt att säkerställa att rätt mängd HVJ-E beskrivs i protokollet bibehålls under cell fusionsprocessen och oocyter behöver returneras till inkubatorn inom 10 min under stegen 6.2.3 – 6.2.5. Eftersom 20 till 30 donatorcellerna kan vara aspirerade tillsammans med HVJ-E i taget i manipulation pipetten, är antalet oocyter som erhållits genom en operation större än den befintliga metoden. I slutändan kan vi producera ungefär 20 till 30 åter Byggyta oocyter inom 10 min. Även när du arbetar med en stor sats av oocyter (100 eller fler), cell fusion förfarandet bör ta en timme eller mindre genom att upprepa stegen 6.2.3 – 6.2.5. Metod och tekniker som presenteras här kan fungera som effektiva protokoll med förenklade tekniska krav.
Närvarande är de molekylära mekanismerna bakom utvecklingen av SCNT embryon fortfarande oklart. Denna förbättrade SCNT-metod bidrar också till studera sådan omprogrammering mekanismer, eftersom denna metod kan producera många klonade embryon i bara ett experiment. Denna metod använder kroppsceller med intakt cellmembran för Cellfusion. Således kan det vara möjligt att tillämpa denna strategi till andra celler såsom tail tip celler16, sertoli celler17och embryonala stamceller (ES) celler18. När konventionella SCNT metoder används för att injicera relativt stora celler, såsom tail tip-cellerna, direkt in i äggcellen cytoplasman, det blir även mer tekniskt krävande att få levande embryon. Dessutom är relativt hård celler, såsom sertoli celler, svåra att bryta genom pipettering för att injicera. När dessa olika celltyper anses vara är metoden cell fusion utnyttja HVJ-E enkel och effektiv. Även om det värdet och säkerhet HVJ-E har övertygande visat19,20, kan det vara viktigt att åter överväga möjligheten att använda HVJ-E för att producera klonade djur för jordbruks- eller biomedicinska ändamål.
Dessutom producerade nyligen en grupp framgångsrikt klonat möss härstammar från urin celler21. För att rädda utrotningshotade däggdjur, kommer hädanefter SCNT använder cellerna samlas i ett icke-invasivt sätt, till exempel urin cellen, vara perfekt. Mer nyligen, en annan grupp direkt har genererat klonade möss använder antigen-specifika CD4+ T cells22. Det vore intressant att undersöka om denna metod är också tillämpliga på effektivt klona möss från sådana celler. Latrunculin A har dessutom rapporterats som ett bättre alternativ för att hämma aktin polymerisation under enucleation och partenogenetiska aktivering av SCNT oocyter23. Framtida studie kan avslöja om Latrunculin A behandlingen, i stället för cytochalasin B, ytterligare förbättrar generation av klonade avkomma. Dessutom har TSA behandling framgångsrikt använts i möss, grisar24och kaniner25 genom att ändra behandlingstid, period och koncentration. Dessutom VC inte bara förbättrar embryonal utveckling i svin SCNT10, men förbättrar också iPS cellproduktion hos människor och möss26. Det är således rimligt att spekulera TSA och VC behandling kan också tillämpas på andra däggdjursarter, som vi kan behöva optimera behandlingstiden av TSA och VC för varje art.
Avslutningsvis skulle denna metod göra det möjligt att generera klonade möss med en praktisk nivå av effektivitet med enkla rutiner. Därför kan resultaten av denna studie leda oss att använda SCNT tekniken för att bevara genetiska resurser av sällsynta djur, och för att förstå de molekylära mekanismerna av nukleära omprogrammering och tidig embryonal utveckling.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av JSPS KAKENHI grant nummer JP15H06753, JP16H01321, JP16H01222, JP17H05045 till K.M. Sumitomo Foundation Grant för grundläggande forskningsprojekt (150810 till K.M.). Kindai universitet forskningsanslag (15-I-2 K.M. och M.A.). M.O. bekräftar core stöd som tillhandahålls av Cancer Research UK (C6946/A24843) och Wellcome Trust (203144/Z/16/Z). Vi tackar Ms. N. Backes-Kamimura och Mr J. Horvat för korrekturläsning.
NaCl | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | 28-2270-5 | For medium |
KCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-03542 | For medium |
KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 165-04242 | For medium |
MgSO4 · 7H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 137-00402 | For medium |
CaCl2 · 2H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 039-00431 | For medium |
D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | For medium |
Sodium Pyruvate | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 199-03062 | For medium |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | G3126 | For medium |
Polyvinylpyrrolidone | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 168-17042 | For medium |
NaHCO3 | Nacalai tesque, Inc. | 31213-15 | For medium |
Sodium DL-Lactate | Nacalai tesque, Inc. | 31605-72 | For medium |
Penicillin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222637671 (GTIN-13) | For medium |
Streptomycin | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | 4987222665643 (GTIN-13) | For medium |
Sterile water, endotoxin free | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 196-15645 | For medium |
EDTA · 2Na | Dojindo Lab. | 345-01865 | For medium |
Phenol red | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P0290 | For medium |
HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3784 | For medium |
Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | P8136 | For medium |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A3311 | For medium |
BT AG 501-X8 (D) Resin | Bio-Rad Lab., Inc. | 143-7425 | For preparation of dBSA |
Hyaluronidase | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | H3506 | For collection of oocytes and cumulus cells |
Cytochalasin B | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 034-17554 | For enucleation and oocytes activation |
Piezo micro manipulator | Prime tech, Co., Ltd. | PMM-150FU | For micromanipulation |
HVJ Envelope Cell Fusion Kit GenomONE-CF | Ishihara sangyo kaisha, Ltd. | CF001 | Containing 0.5 mL of HVJ-E suspension solution and 10 mL of cell fusion buffer for cell fusion |
SrCl2 · 6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 193-09442 | For oocytes activation |
EGTA | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | E8145 | For oocytes activation |
Dimethyl sulfoxide | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 045-24511 | For solvent |
Trichostatin A | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | T1952 | For incubating with SCNT embryos |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | A5960 | For incubating with SCNT embryos |
Mineral oil | Sigma-Aldrich, Co., Lcc. | M8410 | For covering medium |