냉동 절편을 위한 자기 나노입자 전착 바이러스성 벡터를 사용하여 1 차적인 마우스 장 오르가노이드의 유전 공학
Summary
우리는 단계별 지침을 설명합니다 : 1) 렌티 또는 레트로 바이러스 변환을위한 자기 나노 입자를 사용하여 장 오르가노이드를 효율적으로 엔지니어링하고, 2) 엔지니어링 된 오르가노이드에서 냉동 섹션을 생성합니다. 이 접근은 다운스트림 효력의 조사를 위한 organoids에 있는 유전자 발현을 능등하게 바꾸는 강력한 공구를 제공합니다.
Abstract
장 내 오르가노이드 배양은 시험관내에서 장 줄기 세포를 조사하고 생물학을 토굴할 수 있는 독특한 기회를 제공하지만, 오르가노이드의 유전자 발현을 조작하는 효율적인 접근법은 이 분야에서 제한된 진전을 이루었습니다. CRISPR/Cas9 기술은 오르가노이드 생성을 위한 세포의 정확한 게놈 편집을 허용하는 동안, 이 전략은 시간 소모적이고 비용이 많이 드는 서열 분석에 의하여 광범위한 선택 및 검열을 요구합니다. 여기에서, 우리는 장 오르가노이드의 능률적인 바이러스성 전송을 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 접근 방식은 빠르고 매우 효율적이므로 CRISPR/Cas9 기술에 내재된 시간과 비용을 줄입니다. 우리는 또한 유전자 발현 또는 침묵을 확인하기 위하여 이용될 수 있는 면역 조직화학또는 면역형광 염색을 가진 추가 분석을 위한 본래 오르가노이드 문화에서 동결된 단면도를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 유전자 발현 또는 침묵에 대한 바이러스 벡터의 성공적인 환전이 달성된 후, 장 줄기 세포 및 토굴 기능을 빠르게 평가할 수 있다. 대부분의 오르가노이드 연구는 시험관 내 분석을 사용하지만, 오르가노이드는 생체 내 기능 분석을 위해 마우스에 전달될 수 있습니다. 더욱이, 우리의 접근은 현재 유효한 치료가 일반적으로 게놈을 바꾸기 보다는 오히려 유전자 발현 또는 단백질 기능을 변조해서 작동하기 때문에 약에 치료 반응을 예측하기 위한 유리합니다.
Introduction
장기간에 걸쳐 소장이나 결장에서 3차원 (3D) 오르가노이드로 마우스 또는 인간 토굴 세포를 배양하는 능력은 이러한 문화가 생체 내에서 장 상피의 특징을 정의하기 때문에 중요한 돌파구를 제공했습니다. 1개 , 2개 , 3. 기본 토굴에서 파생 된 오르가노이드는 자기 갱신 및 자기 조직능력이 뛰어나며, 기원조직과 유사한 세포 기능을 나타낸다. 실제로, 오르가노이드는 생체 내 토굴의 구조적 조직뿐만 아니라 많은 분자 특징을 재구성하여 정상적인 생물학 및 질병 상태를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 설명하기 위하여, organoid 연구 결과는 조직 재생에관련시킨 새로운 분자 통로를 밝혔습니다 1, 2,3,4,5 뿐만 아니라 기능을 강화할 수 있는 약 병리학 설정6,7.
장 내 벽 줄기 세포의 연구는 장 내 의 박테리아, 독소 및 기타 병원체로부터 유기체를 보호하기 위해 3-5 일마다 자신을 갱신하는 가장 높은 재생 포유류 조직 중 하나이기 때문에 특히 관심이 있습니다. 장 루멘. 장 줄기 세포 (ISCs)는이 놀라운 재생 능력에 대한 책임이 있으며, 따라서 성인 줄기 세포기능을 공부하기위한 독특한 패러다임을 제공 1,2. 마우스의 계보 추적 실험은 분리된 Lgr5 양성 줄기 세포가 생체 내 대조물과 밀접하게 미러링되는 체외에서 3D 오르가노이드 또는 ‘미니 장’을 생성하기 위해 배양될 수 있음을 입증했습니다. 오르가노이드 배양은 또한 전구, ISCs 및 판세포로 구성된 장내 토굴 세포 분리체로부터 유래될 수 있으며, 그 중 후자는 생체 내 상피 틈새 세포를 구성한다. 사실, 1 차 적인 창 자 crypt 세포에서 organoid 문화는 널리 이용 가능한 시약을 사용 하 여 대부분의 실험실에서 구현 하기 쉬운 상대적으로 일상적인 기술로 진화 했다. 이 모델은 또한 질량 분석, 면역성 화학, 또는 면역 형광 염색 2,4,8에의한 RNA-Seq(RNA-Seq) 및 단백질에 의한 유전자 발현의 정량적 분석을 수행할 수 있다. 또한, 기능성 유전학은 기능의 이득(유전자 과발현 또는 활성화 돌연변이 유전자의 발현) 또는 기능 상실(유전자 침묵 또는 기능 상실 돌연변이의 발현)을사용하여 연구될 수 있다 2.
중요한 것은, 폴리브레인을 가진 표준 플라스미드 DNA 또는 바이러스성 감전 프로토콜의 낮은 효율 및 높은 독성은 필드에 있는 중요한 장애물 남아 있습니다. CRISPR/Cas9 기술은 정확한 게놈 편집을 허용하지만, 이 접근법은 시퀀스 유효성 검사9뒤에 시간이 많이 걸리는 선택이 필요합니다. 여기에서, 우리는 자기 나노 입자에 공고하고 자기장의 응용에 의해 바이러스 입자의 전달을 최적화하는 1 차장 오르가노이드를 위한 바이러스성 전달 프로토콜을 제시합니다. 이전 프로토콜 4,5,10,11,12,13 및 효율성을 향상시키기 위한 권장 사항에 대한 주요 수정사항이 제공됩니다. 우리는 또한 면역 조직 화학 또는 면역 형광 염색을 가진 추가 분석을 위해 3D matrigel (이제부터 지하 막 매트릭스 또는 매트릭스로 지칭)에서 배양된 손상되지 않은 오르가노이드에서 냉동 섹션을 생성하는 접근 법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
오르가노이드로서 성인 장 상피의 1차 배양은 줄기세포 기능, 장상피 항상성 및 병리학 1,2,3에 관여하는 분자 메커니즘을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다. 4. CRISPR/Cas9 기술은 오가노이드9를유전자 조작하는 데 사용될 수 있지만 원하는 유전 적 변화에 대한 서열 분석에 기초한 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강의 국립 연구소 (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), 메릴랜드 줄기 세포 연구 기금 (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), 미국 폐 협회, 알레게니 건강 네트워크의 보조금에 의해 지원되었다 홉킨스 연구 기금과 홉킨스 소화기 질환 기초 연구 핵심 센터.
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
Riferimenti
- Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
- Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
- Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent ‘+4’ cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
- Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
- Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
- Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210 (2013).
