यहां, हम समय चूक इमेजिंग और vasculogenesis के विश्लेषण के लिए इन विट्रो चरण इसके विपरीत खुला स्रोत सॉफ्टवेयर के साथ मिलकर माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद, vasculogenesis के काइनेटिक विश्लेषण । इस प्रोटोकॉल को मात्रात्मक कई कोशिका प्रकार या प्रयोगात्मक शर्तों कि मॉडल संवहनी रोग की vasculogenic क्षमता का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Vasculogenesis एक जटिल प्रक्रिया है जिसके द्वारा endothelial स्टेम और जनक कोशिकाओं को डी नोवो पोत गठन से गुजरना पड़ता है. vasculogenesis का मात्रात्मक मूल्यांकन endothelial जनक सेल की कार्यक्षमता का एक केंद्रीय readout बन गया है, और इसलिए, दोनों में इन विट्रो और vivo vasculogenesis मॉडल में सुधार करने के लिए कई प्रयास किए गए हैं । हालांकि, मानक तरीकों स्थिर माप इस अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया के कई पहलुओं पर कब्जा करने में विफल रहने के साथ, दायरे में सीमित कर रहे हैं । इसलिए, इस उपंयास प्रोटोकॉल के विकास के लक्ष्य के लिए इन विट्रो vasculogenesis में कैनेटीक्स का आकलन करने के क्रम में नेटवर्क के गठन और स्थिरीकरण की दर quantitate, साथ ही साथ संभावित तंत्र अंतर्निहित नाड़ी में अंतर्दृष्टि प्रदान करना था रोग. इस प्रोटोकॉल के आवेदन भ्रूण endothelial कॉलोनी बनाने कोशिकाओं (ECFCs) मातृ मधुमेह के लिए उजागर का उपयोग कर प्रदर्शन किया है । भ्रूण ECFCs गर्भनाल रक्त निंनलिखित जंम के बाद से व्युत्पंन थे, संस्कृति, और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स, जिसमें वे vasculogenesis से गुजरती स्लाइड में चढ़ाया । पूरे स्लाइड कुओं की छवियां 15 घंटे से अधिक समय चूक चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर अधिग्रहीत किया गया । छवियां मात्रात्मक डेटा के व्युत्पत्ति के लिए विश्लेषण किया गया एक विश्लेषण Vasculogenesis (KAV) के काइनेटिक विश्लेषण नामक सॉफ्टवेयर का उपयोग । KAV skeletonization द्वारा पीछा छवि विभाजन का उपयोग करता है बहु समय बिंदु चरण कंट्रास्ट छवियों के ढेर से नेटवर्क घटकों का विश्लेषण करने के लिए दस मापदंडों प्राप्त करने के लिए (9 मापा, सहित नेटवर्क संरचना के 1 गणना): बंद नेटवर्क, नेटवर्क क्षेत्रों, नोड्स, शाखाओं, कुल शाखा की लंबाई, औसत शाखा की लंबाई, ट्रिपल-शाखाओं वाले नोड्स, क्वाड-ब्रांच्ड नोड्स, नेटवर्क संरचनाएं, और शाखा के लिए नोड अनुपात । इस प्रोटोकॉल के अनुप्रयोग मधुमेह से जटिल गर्भधारण से प्राप्त ECFCs में vasculogenesis की बदल दरों की पहचान की. हालांकि, इस तकनीक के दायरे से परे व्यापक प्रभाव है यहां की सूचना दी । इस दृष्टिकोण के कार्यांवयन यंत्रवत मूल्यांकन बढ़ाने के लिए और vasculogenesis और अंय कई कोशिका प्रकार या रोग राज्यों में जैविक रूप से महत्वपूर्ण शाखाकरण प्रक्रियाओं के कार्यात्मक readouts में सुधार होगा ।
endothelial जनक कोशिकाओं की क्षमता vasculogenesis से गुजरना करने के लिए, या डी नोवो पोत गठन, विकास के दौरान भ्रूण vasculature की स्थापना में महत्वपूर्ण है1. इसके अतिरिक्त, और पोत गठन और पूर्व मौजूदा जहाजों, जो angiogenesis के रूप में जाना जाता है की परिपक्वता भी विकास में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है और प्रसव जीवन में रक्त प्रवाह और homeostasis बनाए रखने के लिए पूरे शरीर में2। शरीर में हर अंग ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की डिलीवरी के लिए संवहनी प्रणाली पर निर्भर है, और अपशिष्ट के हटाने के लिए3। संवहनी homeostasis बनाए रखा नहीं है, तो ऐसी है कि रक्त वाहिका गठन और मरम्मत या तो अपर्याप्त हैं या अधिक में, संवहनी रोगों के परिणाम कर सकते हैं4. इसलिए, संवहनी गठन और अनुकूलन सामांयतः अध्ययन कर रहे हैं, के रूप में वे अंग स्वास्थ्य के रखरखाव में आवश्यक है और कई रोग राज्यों के विकास में फंसा रहे हैं ।
विकास में संवहनी प्रणाली की भागीदारी के एक वृद्धि की समझ के कारण, के रूप में अच्छी तरह के रूप में रोग अभिव्यक्ति और प्रगति में, परख मॉडल vasculogenesis और angiogenesis इन विट्रो में विकसित किया गया है और vivo में5 ,6,7. मॉडलिंग पोत गठन ऐसे endothelial कोशिकाओं के रूप में संवहनी कोशिकाओं चढ़ाना शामिल है, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में है कि सेल संगठन और पोत नेटवर्क के गठन को बढ़ावा देता है8,9,10। आम तौर पर, रात की गर्मी के बाद, सेल नेटवर्क की छवियों को एक ही समय बिंदु पर कब्जा कर लिया, विश्लेषण के लिए छवियों की एक छोटी संख्या में जिसके परिणामस्वरूप11,12,13। इसलिए, विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण मोटे तौर पर विकसित किया गया है और एकल समय बिंदु आकलन के लिए अनुकूलित10,14। हालांकि, स्थैतिक विश्लेषण पोत गठन की गतिशील प्रक्रिया पर कब्जा करने और शामिल संभावित तंत्र में सीमित जानकारी प्रदान करने में बस अपर्याप्त हैं । हालांकि बढ़ती इमेजिंग आवृत्ति की संभावना आवश्यक डेटा प्रदान करने के लिए गठन कैनेटीक्स की पहचान करेगा, पहले से विकसित विश्लेषिकी के आवेदन एक बहु समय बिंदु इमेजिंग दृष्टिकोण अक्षम और श्रम गहन14होगा । इसके अतिरिक्त, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विश्लेषण के विकास के बावजूद, एक भुगतान प्रति छवि शुल्क इस विकल्प की लागत-काइनेटिक अध्ययन है जिसमें छवियों के हजारों15उत्पंन कर रहे है के लिए निषेध प्रदान करता है । इसलिए, एक सुव्यवस्थित और कुशल दृष्टिकोण को पकड़ने के लिए क्षेत्र में एक की जरूरत है और इन विट्रो मेंvasculogenesis मात्रा, बड़ी छवि का विश्लेषण करने की क्षमता सहित समय चूक रहते सेल माइक्रोस्कोपी द्वारा उत्पंन सेट ।
इन सीमाओं को दूर करने के लिए, एक नया दृष्टिकोण एकल टाइम पॉइंट इमेजिंग के विस्तार के उद्देश्य के साथ विकसित किया गया था छवियों के साथ vasculogenesis के गतिशील मूल्यांकन सक्षम करने के लिए हर 15 मिनट16अधिग्रहीत । कई घंटे से अधिक समय अंक पर कब्जा करके, इस दृष्टिकोण vasculogenesis की प्रक्रिया का एक अधिक विस्तृत चित्रण प्रदान करता है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में संभावित गठन और पोत नेटवर्क के रखरखाव के लिए योगदान तंत्र में अंतर्दृष्टि । आवृत्ति और छवि अधिग्रहण की गुणवत्ता में सुधार के अलावा, इस दृष्टिकोण एक खुला स्रोत प्लग के रूप में उपंयास सॉफ्टवेयर शामिल है-17में । सॉफ्टवेयर, Vasculogenesis (KAV) के काइनेटिक विश्लेषण के रूप में भेजा, एक सुव्यवस्थित आवेदन है कि छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण विशेष रूप से बड़ी छवि बहु समय बिंदु अधिग्रहण से उत्पंन सेट के लिए शामिल है । KAV छवि विभाजन के माध्यम से चरण कंट्रास्ट छवियों का विश्लेषण करती है skeletonization द्वारा पीछा किया18। नेटवर्क संरचना के दस मापदंडों सहित KAV द्वारा मात्रा हैं: शाखाओं, बंद नेटवर्क, नोड्स, नेटवर्क क्षेत्रों, नेटवर्क संरचनाओं, ट्रिपल शाखाओं में बंटी नोड्स, quad-शाखाओं में बंटी नोड्स, कुल शाखा की लंबाई, औसत शाखा की लंबाई, और शाखा के लिए नोड अनुपात (देखें चित्रा 1)16में योजनाबद्ध । KAV दृष्टिकोण के आवेदन एक उपंयास भी शामिल है, इन विट्रो vasculogenesis में की गणना की phenotype, नोड अनुपात को शाखा के रूप में जाना जाता है । हमारे हाल के काम का प्रदर्शन किया है कि इस अनुपात नेटवर्क कनेक्टिविटी का संकेत है और अंय सेलुलर नेटवर्क के गठन में शामिल प्रक्रियाओं, जैसे गतिशीलता16के साथ जुड़ा हो सकता है ।
हालांकि भ्रूण endothelial कॉलोनी बनाने सेल (ECFC) vasculogenesis इन अध्ययनों में मूल्यांकन किया गया था, इस छवि अधिग्रहण और विश्लेषण दृष्टिकोण आसानी से किसी भी सेल प्रकार है कि vasculogenesis या angiogenesis से गुजरना मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, इस दृष्टिकोण को बदल नाड़ी रोग राज्यों, जैसे गर्भावधि मधुमेह हो सकता है, के रूप में इन अध्ययनों में दिखाया गया है की एक किस्म से जिसके परिणामस्वरूप समारोह की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा कर सकते हैं । इसके अलावा, इस विधि के लिए नेटवर्क के गठन और शाखाओं का आकलन है, जो अंय जैविक रूप से प्रासंगिक प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है अनुकूलित किया जा सकता है । इस प्रकार, अद्वितीय जैविक प्रणालियों के लिए इस उपंयास दृष्टिकोण लागू करने के संभावित प्रभाव अभी तक निर्धारित किया जाना है ।
KAV एकाधिक समय बिंदुओं के साथ बड़े डेटा सेट का मूल्यांकन सक्षम करता है
परंपरागत रूप से, quantitation इन विट्रो में vasculogenesis के एक एकल, या कुछ समय बिंदु माप शामिल किया गया है । यह स्थिर दृष्टिकोण बस पर कब्जा करने और एक गतिशील और जटिल प्रक्रिया को बढ़ाता है के लिए अपर्याप्त है । इसलिए, इस उपंयास विधि के लिए नेटवर्क गठन कैनेटीक्स के कुशल विश्लेषण सक्षम करने के लिए संभावित आणविक vasculogenesis के गतिशील प्रक्रिया में शामिल तंत्र में अंतर्दृष्टि लाभ विकसित किया गया था । दक्षता और स्वचालन उपंयास तकनीक के विकास में महत्वपूर्ण घटक उत्पंन करने और इमेजिंग डेटा की बड़ी मात्रा का विश्लेषण कर रहे हैं । KAV विशेष रूप से बड़ी छवि छवियों के सैकड़ों से मिलकर ढेर समय और श्रम समय चूक डेटा सेट से जैविक रूप से सार्थक निष्कर्ष निकलने के लिए आवश्यक कमी का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया था । महत्वपूर्ण बात, KAV छोटे के लिए सेकंड के एक मामले में छवि प्रसंस्करण और डेटा पीढ़ी का आयोजन करता है (कम से १०० छवियों) छवि ढेर और बड़ा के लिए मिनट (१०० से अधिक छवियों) छवि स्टैक, अद्वितीय दक्षता में जिसके परिणामस्वरूप. इसके अतिरिक्त, समय और मापदंडों द्वारा स्प्रेडशीट में डेटा संगठन मापा जाता है सक्षम बनाता है चित्रमय प्रस्तुति और सांख्यिकीय विश्लेषण के तेजी से पीढ़ी ।
इस दृष्टिकोण के सफल अनुप्रयोग में चुनौतियां
हालांकि इस परख दोनों छवि अधिग्रहण और विश्लेषण करने के लिए सुधार भी शामिल है, कुछ चुनौतियों का सफल कार्यांवयन में बाधा हो सकती है । चार मुख्य बाधाओं नमी स्थिरता, छवि अधिग्रहण, सॉफ्टवेयर और हार्डवेयर विश्वसनीयता के लिए चढ़ाना से समय परिशुद्धता, और बड़े डेटा प्रत्येक प्रयोग के लिए उत्पंन सेट के प्रबंधन शामिल हैं । कई घंटे से अधिक स्थिर लाइव सेल इमेजिंग चुनौतीपूर्ण हो सकता है । विशेष रूप से, उपयुक्त और संगत humidification इमेजिंग कक्षों के लिए आवश्यक है । Angiogenesis स्लाइड इस परख है, जो parallelizing मैट्रिक्स के लिए डिजाइन किए है Angiogenesis परख आधारित में उपयोग किया जाता है । उनकी कम मात्रा, लगभग ५० µ एल, वाष्पीकरण और संघनित्र विस्तारित संस्कृति की स्थिति के लिए महत्वपूर्ण विचार करता है । इस प्रयोगात्मक मुद्दे का मुकाबला करने के लिए, यह एक मशीन है कि नमी को विनियमित का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । हालांकि, यह भी अगर इमेजिंग चैंबर के अत्यधिक सुखाने समय पर होता है इस विनियमन बढ़ाने के लिए आवश्यक हो सकता है । हमने पाया है कि सबसे सरल दृष्टिकोण नमी बढ़ाने के लिए चैंबर में पानी की सतह क्षेत्र को बढ़ाने के लिए है । इस लक्ष्य को पूरा करने के लिए, हमारे प्रोटोकॉल निंनलिखित तीन जल स्रोतों से पता चलता है: एक दूसरे चैम्बर पानी से भरा स्लाइड, जो भी है जहां मशीन तापमान मापा जाता है, स्लाइड पर कुओं के आसपास के क्षेत्र में पानी, और गीला फ़िल्टर कागज या पोंछे. इसके विपरीत, संघनित्र तब होता है जब कमरे में हवा का तापमान स्लाइड के नीचे ठंडा हो जाता है और चैंबर के अंदर की आर्द्रता स्लाइडों और कुओं पर गाढ़ा होती है । इस जटिलता सेल मीडिया और एक लेंस प्रभाव है कि चरण के विपरीत के साथ हस्तक्षेप के कमजोर पड़ने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इन अध्ययनों में, स्लाइड के तल पर गर्म हवा (39-42 डिग्री सेल्सियस) के आवेदन के माध्यम से कम किया गया ।
किसी भी समय चूक अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण विचार प्रयोग दीक्षा और इमेजिंग के बीच निरंतरता है । जब इमेजिंग शुरू होता है के समय के बहाव की घटनाओं की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण है । इस परख के समय परिशुद्धता सुनिश्चित करने के लिए, प्रारंभिक चढ़ाना और पहली imaged समय बिंदु के बीच बार कसकर नियंत्रित किया जाना चाहिए । व्यवहार में, इस ‘ डेड टाइम ‘ को कम किया जा सकता है, लेकिन अधिक महत्वपूर्ण बात, यह तुलना करने के लिए विभिन्न दिनों पर प्रयोगों की अनुमति के अनुरूप होने की जरूरत है. उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में हम लगभग 30 मिनट के एक मृत समय की उंमीद है । इससे प्रायोगिक तैयारी और इमेजिंग सुविधाओं की निकटता से सुविधा की जा सकती है.
क्या पहली नज़र में सांसारिक विवरण की तरह लग सकता है सॉफ्टवेयर, हार्डवेयर स्थिरता, और डेटा प्रबंधन के लिए महत्वपूर्ण हैं । सॉफ़्टवेयर और संबद्ध हार्डवेयर ड्राइवर्स, नेटवर्क परिवेश और स्वचालित सॉफ़्टवेयर अद्यतन सभी सॉफ़्टवेयर की स्थिरता को प्रभावित करते हैं । यह एक “शुष्क भागो” में इस प्रोटोकॉल के परीक्षण के लिए बाधाओं और छवि अधिग्रहण में समस्याओं के संभावित स्रोतों की पहचान करने के लायक है; उदाहरण के लिए, अविश्वसनीय लाइव सेल सेटअप, स्टेज, शटर, और कैमरा विश्वसनीयता और स्वचालित ऑपरेटिंग सिस्टम और सॉफ़्टवेयर अद्यतनों पर संस्थागत सूचना प्रौद्योगिकी नीतियों के लिए जांच करें ।
डेटा प्रबंधन किसी भी इमेजिंग प्रयोग है कि छवियों के हजारों के लिए सैकड़ों उत्पंन की एक निरंतर चिंता का विषय है । सौभाग्य से, वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर अक्सर उपलब्ध अंतरिक्ष के लिए एक इमेजिंग प्रयोग शुरू करने से पहले की जांच । हालांकि, इस परख भी पोस्ट-कैप्चर छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण है कि हार्ड ड्राइव अंतरिक्ष बोझ को जोड़ सकते है और इमेजिंग प्रयोगों के साथ हस्तक्षेप, यदि उपलब्ध स्थान सीमित है शामिल हैं । इसके अलावा, सुरक्षा और कंप्यूटर की स्थिरता की गारंटी नहीं किया जा सकता, भी हार्डवेयर समाधान जैसे समान डिस्क की एक अनावश्यक सरणी के साथ । इस प्रकार, एक डेटा प्रबंधन रणनीति के लिए चल रहे प्रयोगों और एक मजबूत दूरदराज के संग्रह के लिए कंप्यूटर की हार्ड ड्राइव पर अंतरिक्ष सुनिश्चित करने के लिए, उदाहरण के लिए एक संस्थागत संग्रह संसाधन के साथ, आवश्यक है ।
छवि गुणवत्ता को अधिकतम करने के लिए रणनीतियां
हालांकि KAV की क्षमता को सही मैट्रिक्स पृष्ठभूमि से ECFCs विचार मजबूत है, परख की संवेदनशीलता छवि गुणवत्ता पर निर्भर है । उदाहरण के लिए, यदि छवि कम कंट्रास्ट है, तो सॉफ़्टवेयर कम सटीकता (चित्र 2B) के साथ सेल नेटवर्क्स का पता लगाएगा । चरण इसके विपरीत की गुणवत्ता कई कारकों से प्रभावित है, छवि अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल माइक्रोस्कोप की सेटिंग सहित, मैट्रिक्स की लोडिंग और परख तैयारी के दौरान सेल निलंबन मीडिया, और कुओं के भीतर मीडिया के स्तर के रखरखाव इमेजिंग के दौरान । इन परख के लिए चरण इसके विपरीत अनुकूलन, मामूली समायोजन करने के लिए माइक्रोस्कोप में चरण अंगूठी संरेखण के विपरीत सुधार किए गए । इसके अतिरिक्त, नमूना तैयारी कड़ाई से बराबर और लगातार मीडिया लोडिंग सुनिश्चित करने के लिए परीक्षण किया गया था । यदि मैट्रिक्स और/या कुओं में भरी हुई मीडिया की राशि या तो नीचे या इष्टतम सीमा से ऊपर है, एक meniscus बदल चरण कंट्रास्ट के लिए अग्रणी फार्म कर सकते हैं । अंत में, कुओं में तरल की छोटी मात्रा के कारण, यह वाष्पीकरण और संघनित्र को कम करके मीडिया के स्तर को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में ऊपर उल्लेख किया । कुल मिलाकर, परख अनुकूलन के लिए विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता कंट्रास्ट छवियां उत्पंन महत्वपूर्ण है ।
चरण इसके विपरीत गुणवत्ता के अलावा, अंय कारकों को भी मीडिया संदूषण, मैट्रिक्स में खामियों, और कणों या मैट्रिक्स या मीडिया में मलबे सहित परख परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं । संदूषण इस परख का खतरा है क्योंकि यह कई घंटे से अधिक एक सूक्ष्म चैंबर में रहते सेल इमेजिंग शामिल है । संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए, मैट्रिक्स और सेल सस्पेंशन एक बाँझ डाकू में स्लाइड पर लोड कर रहे हैं । इसके अलावा, प्रत्येक नमूना आम तौर पर एक प्रयोग के लिए डुप्लिकेट या तपसिल में चढ़ाया जाता है के कारण डेटा की हानि के जोखिम को कम करने के लिए अप्रत्याशित मुद्दों जैसे मलबे या विश्लेषण को मिला कणों ।
नमूना विविधता ड्राइव वृद्धि की परख संवेदनशीलता के लिए की आवश्यकता
विविधता मनाया गया है और ECFCs के पिछले अध्ययनों में रिपोर्ट GDM13से अवगत कराया । सेल समारोह में विविधता के एक उच्च स्तर पर इन नमूनों में मनाया मातृ रोग की गंभीरता, रोग की अवधि, और प्रबंधन के लिए रक्त शर्करा के स्तर को विनियमित इस्तेमाल शैली सहित कई कारकों के कारण अटकलें है । महत्वपूर्ण बात, यह विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण ECFC vasculogenesis की गतिशील रेंज कब्जा, यह phenotypic गर्भधारण से नमूनों में कार्यात्मक विविधता के कारण मतभेदों की पहचान करने के लिए संभव बना रही है । कुल मिलाकर, प्राथमिक रोगी नमूनों का उपयोग, जैसे इन अध्ययनों में प्रयुक्त होने वाले, एक सेल लाइन की तुलना में बड़ा परिवर्तनशीलता लागू कर सकते हैं । के रूप में अधिक से अधिक जोर अनुवाद कार्यात्मक परिवर्तनशीलता के साथ कई प्राथमिक पशु या मानव नमूनों को शामिल अध्ययन पर रखा गया है, परख संवेदनशीलता का पता लगाने और जैविक रूप से सार्थक माप और निष्कर्ष के व्युत्पत्ति के लिए आवश्यक है । इसलिए, KAV जैसे दृष्टिकोण के विकास की मात्रा और डेटा की गुणवत्ता में सुधार होगा द्वारा उत्पंन इन विट्रो vasculogenesis और angiogenesis परख और अधिक मजबूत टिप्पणियों और निष्कर्षों को सक्षम करने के लिए । इसके अलावा, इन आंकड़ों अंतर्निहित आणविक तंत्र की भविष्य की जांच की सुविधा है कि बदल ECFC vasculogenesis अंतर्गर्भाशयी GDM एक्सपोजर निंनलिखित योगदान के लिए होगा ।
इस दृष्टिकोण के भविष्य अनुप्रयोगों
हालांकि इस विधि इन अध्ययनों में इन विट्रो में भ्रूण ECFC vasculogenesis का आकलन करने के लिए लागू किया गया था, इस दृष्टिकोण के संभावित अनुप्रयोगों के कई हैं. इस तकनीक को आसानी से किसी भी कोशिका जनसंख्या है कि vasculogenesis या angiogenesis की प्रक्रियाओं में भाग का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । विशेष रूप से, यह व्यक्तिगत कोशिका आबादी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में इस अध्ययन में प्रदर्शन किया गया था, लेकिन यह भी सह संस्कृति प्रणालियों के लिए लागू किया जा सकता है । भविष्य में, यह दो से परे इस दृष्टिकोण का विस्तार करने के लिए लाभकारी होगा आयामी इन विट्रो परख तीन आयामी (3d) मॉडल का आकलन करने के लिए. हालांकि KAV के वर्तमान संस्करण quantitating 3d इमेजिंग डेटा के लिए अपर्याप्त होगा, एक समान रूप से डिजाइन समय चूक, बहु-पैरामीट्रिक विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण विशेष रूप से 3 डी के लिए या vivo में मॉडल यदि अवलोकन दो-आयामों में किए गए सूचित करेंगे इन विट्रो में एक अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक सेटिंग में सेल समारोह के प्रतिनिधि हैं ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक लुसी मिलर, Leanne Hernandez, डॉ डेविड हास, ब्रिटनी Yeley (इंडियाना यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन), डॉ करेन Pollok, जूली मुंद, मैथ्यू दर्रा स्वीकार करते हैं, और एमिली Sims (एंजियो इंडियाना विश्वविद्यालय शमौन कैंसर केंद्र में) ECFC नमूनों को संस्थाओ में उत्कृष्ट तकनीकी सहायता । लेखक भी डीआरएस को स्वीकार करते हैं । मॉरीन ए. Harrington, एडवर्ड एफ Srour, रिचर्ड एन दिवस, Mervin सी. Yoder, और मथायस ए क्लॉस (इंडियाना विश्वविद्यालय चिकित्सा के स्कूल) के विद्वानों के रूप में अच्छी तरह के रूप में जेनिस की दीवारों (इंडियाना विश्वविद्यालय चिकित्सा के स्कूल) के लिए व्यवस्थापकीय समर्थन । सभी इमेजिंग जैव माइक्रोस्कोपी, इंडियाना विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन के लिए इंडियाना केंद्र में प्रदर्शन किया था । यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R01 HL094725, P30 CA82709, और U10 HD063094) और रिले बच्चों की नींव द्वारा समर्थित किया गया था । इसके अतिरिक्त, इस प्रकाशन संभव राष्ट्रीय दिल से आंशिक समर्थन के साथ बनाया गया था, फेफड़े, और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के रक्त संस्थान पुरस्कार के तहत # T32 HL007910 ।
100mm Tissue Culture Plates | Fisher | 353003 | |
15ml conical tubes | Fisher | 1495949B | |
Angiogenesis 15-well micro-slides | Ibidi | 81506 | |
Matrigel | Fisher (Corning) | 354234 | |
EGM2 Medium | Lonza | CC3162 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
PSA Antimyocytic, Antibiotic | Fisher | MT30004C1 | Added 5 milliliters per 500 milliter bottle of EGM2 medium. |
0.5% Trypsin/0.53nM EDTA in HBSS | Fisher (Corning) | MT25052CI | |
Type 1 Collagen | Fisher (Corning) | 354226 | 100mg of liquid, concentration range 3-4mg/mL. Dilute in 20nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05mg/mL. |
Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20nM. |
Kim Wipes | Fisher | 06-666 | |
Chambered slide | Ibidi | 80296 | This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher (Gibco) | 20012027 | 1x solution, pH 7.2 |
Microscope | Nikon Instruments | MEA53100 and MEF55030 | Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective |
Stage | Prior Instruments | ProScan II | Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used |
Objective | Nikon Instruments | 93178 | CFI Plan Fluor DL 10x |
Camera | Hamamatsu | C11440-42U | ORCA Flash 4.0LT |
Stage Blower | Precision Controls | N/A | This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments |
Stage-top Incubator | OKOLabs | H301 | BoldLine including a two position slide holder |
Computer | Hewlett-Packard | Z620 or equivalent | 4 core Intel Xeon processor, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card |
Nikon Elements Software | Nikon Instruments | AR v 4.20 | ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software. |
FIJI (ImageJ) Software | N/A | N/A | Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
KAV Plug-In | N/A | N/A | Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis |