Farelerden Pankreas Adacık İzolasyon için Basit Bir Yüksek Verimlilik Protokolü
Summary
Bu adacık izolasyon protokolü ekroz dokuyu sindirmek için kollajenaz enjeksiyonunun yeni bir rotasını ve adacıkları farelerden arındırmak için basitleştirilmiş bir degrade prosedürünü tanımlamıştır. Enzimatik sindirim, degrade ayırma/arıtma ve adacık el toplama içerir. Başarılı yalıtım fare başına 250-350 yüksek kaliteli ve tam işlevsel adacıklar verebilir.
Abstract
Pankreas adacıkları, ayrıca Langerhans Adacıkları denir, glikoz regülasyonu ve diğer önemli biyolojik fonksiyonlar için hormonüreten endokrin hücrelerin bir küme vardır. Adacıklar öncelikle beş tür hormon salgılayan hücreden oluşur: α hücreleri glukagon salgılar, β hücreleri insülin salgılar, δ hücreleri somatostatin salgılar, ε hücreleri ghrelin salgılar, ve PP hücreleri pankreas polipeptidi salgılar. Adacıklarda hücrelerin %60-80’i insülin salgısını inceleyen en önemli hücre popülasyonu olan β hücreleridir. Pankreas adacıkları ex vivo insülin salgısını incelemek için önemli bir model sistemidir. Yüksek kaliteli adacıklar elde diyabet araştırma için büyük önem taşımaktadır. Çoğu adacık izolasyon prosedürleri kollajenaz enjeksiyon, sert ve karmaşık sindirim prosedürleri ve birden fazla yoğunluk gradyan arıtma adımları siteye erişmek için teknik olarak zor gerektirir. Bu kağıt ayrıntılı açıklamalar ve gerçekçi gösteriler ile basit bir yüksek verimli fare adacık izolasyon yöntemi özellikleri, aşağıdaki özel adımları gösteren: 1) Vater ampulla kollajenaz P enjeksiyonu, pankreas kanalı katılmadan küçük bir alan ve ortak safra kanalı, 2) enzimatik sindirim ve eknotrin pankreas mekanik ayırma, ve 3) tek bir degrade arıtma adımı. Bu yöntemin avantajları Vater daha erişilebilir ampulla kullanarak sindirim enzim enjeksiyonu, enzimomatik ve mekanik yaklaşımlar kombinasyonu kullanarak daha eksiksiz sindirim ve basit bir tek degrade arıtma adımı vardır. Bu protokol fare başına yaklaşık 250-350 adacık üretir; ve adacıklar çeşitli ex vivo çalışmalar için uygundur. Bu prosedürün olası uyarılar potansiyel olarak enzimatik sindirim ve / veya uzun gradyan kuluçka nedeniyle adacıklar zarar görmüş, tüm bunlar büyük ölçüde kuluçka süresi dikkatli reklam gerekçesi ile önlenebilir.
Introduction
Pankreas adacık izolasyonu için literatürde iki ortak yöntem vardır. Bir pankreas excising ve cerrahi makas kullanarak küçük parçalar halinde doğrama gerektirir, ve sonra bir kollajenaz çözeltisi içinde sindirerek1,2,3. Başka bir daha kesin yöntem sindirim enzimi tanıtmak için pankreas mevcut kanalların ağ kullanmaktır. Aşağıdaki siteler sindirim enzim enjeksiyonu için kullanılmıştır: safra ve kistik kanal kavşağı, ortak safra kanalı içine safra kesesi, ya da ortak safra kanalı kendisi1,4,5. Bu adacıklar eşit pankreas dağıtılan olmadığı bilinmektedir; dalak bölgesi en çok adacık içerir6. Sindirim enzimleri sunmak için anatomik yolları kullanarak ikinci yöntem pankreas daha tam bir perfüzyon sağlar iken, dalak bölgesi de dahil olmak üzere, Bu prosedür genellikle teknik olarak Vater ampulla sıkma veya dikiş gerektirir Zorlu. Adacık arınma açısından, birden fazla yoğunluk gradyanları yanı sıra hücre süzgeçleri ve manyetik geri çekme adacıkları arındırmak için kullanılmıştır3,7. Bu degradelerin kullanımı zaman alıcı olabilir ve Ficoll gradyanları adacıklarıntoksik hasarına neden olabilir 8.
Mevcut protokol Li ve ark.7tarafından açıklanan yöntem üzerine inşa edilmiştir , ek değişiklikler kendimizi ve başkalarının deneyimine dayalı eklendi1,4. Protokolümüzün en kritik adımları karaciğer ucuna yakın ortak safra kanalı nın kenetlenme, eknotrin dokuyu sindirmek için Vater ampulla kolajenaz P enjekte ve sonra mekanik sindirim hızlandırmak için sallayarak su banyosu kullanarak1, 4,7. Daha sonra, adacıkların daha fazla sindirimini engellemek için bir ‘STOP’ çözeltisi uygulanır; HBSS kalan kollajenaz P ve STOP çözeltisini yıkamak için kullanılır. Ficoll yöntemi insan adacıkları arındırmak için kullanıldığında, verim iki kat daha fazla fonksiyonel yeteneği (örneğin, insülin salgılanma) percoll gradyanların kullanımı ile karşılaştırıldığında adacıklar olduğu bildirilmiştir9. Ancak, çalışmalar ficoll gradient adacıklar üzerindeki toksik etkisi nedeniyle kullanımını sorguladı1,10. Bu Histopaque gradyan fare adacık izolasyon için optimum arıtma kinetiği sağlar bildirilmiştir, hangi basit adımlar ve daha düşük maliyet ile yüksek kaliteli adacıklar iyi verim üretir1. Protokolümüzde, Histopaque-1077 diğer artık doku8,11adacıkları arındırmak için kullanılır. Hasat adacıkları tam RPMI-1640 ortamiçinde kültürlenebilir veya doğrudan RNA/protein nicelemesinde kullanılabilir.
Bizim protokol, kollajenaz P sindirim ve tek bir degrade arıtma adımı bir arada kullanarak, diğer yayınlanan protokolleri daha basittir. Yöntemimiz zorlu cerrahi prosedürler gerektirmez ve sadece birkaç basit adımvardır. Daha da önemlisi, bu protokol sürekli olarak yüksek kaliteli fonksiyonel adacıklar iyi bir verim üretir (250-350/fare) olarak biz12bildirdi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol kollajenaz perfüzyon ve sindirim, adacıkların arınma izledi içerir. Bu protokolün en kritik adımları etkili enjeksiyon ve pankreas tam perfüzyonvardır 1,4,7. Bu protokolün teslim yöntemi enzim daha iyi adacıklar çevreleyen ekzonrin doku sindirmek için anatomik yolları çapraz sağlar1. Buna ek olarak, bu teknik de adacıkların en yüksek konsantrasyona sahip dalak bölgesi, ta…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz şematik diyagramonu sanatsal illüstrasyon için Bayan Jennifer Munguia son derece müteşekkiriz. Biz Bay Michael R. Honig Houston Topluluk Kamu Radyo İstasyonu KPFT onun editoryal yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma Amerikan Diyabet Derneği #1-15-BS-177 (YS) ve NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma usda Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü, Hatch projesi 1010840 (YS) ve R01 DK095118 (SG) tarafından da desteklenmiştir.
Materials
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P – this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube – swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
Riferimenti
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- O’Dowd, J. F. The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans. Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).
- Wang, X. Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas – Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes. PLOS ONE. 8, (2013).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).
- Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients. Surgery. 107 (5), e50374 (1987).
- Salvalaggio, P. R. Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function. Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).
- Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans. Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).
- Pradhan, G., et al. Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R. Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).
- Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion–a comparison with standard technique. Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).
