Drosophila 테트로도톡신 저항 나트륨 채널을 사용 하 여 Monosynaptic 연결 검사
Summary
이 문서는 테트로도톡신와 테트로도톡신 저항 나트륨 채널, NaChBac 채용 하 여 뉴런 사이의 monosynaptic 연결을 테스트 하는 방법을 갖추고 있습니다.
Abstract
여기, 새로운 기술은 불린다 Tetrotoxin (TTX) 설계 저항에 대 한 프로 빙 Synapses (TERPS) 대상 뉴런 간의 monosynaptic 연결에 대 한 테스트에 적용 됩니다. 메서드는 특정 연 접 신경에서 테트로도톡신 저항 나트륨 채널, NaChBac, 유전자 변형 활성기의 공동 식에 의존합니다. 상 상속 후 시 냅 스 파트너와 연결 TTX, NaChBac을 표현 하지 않는 뉴런의 전기 활동을 차단 존재 전체 세포 기록에 의해 결정 됩니다. 이 방법은 활성 또는 연결의 기자로 서 칼슘 이미징 작업을 수정할 수 있습니다. TERPS 성장 네트워크에서 연결을 결정 하는 데 사용할 수 있는 도구 집합을 추가 합니다. 그러나, TERPS는 독특한에 또한 안정적으로 대량 또는 볼륨 전송 및 전송 일 좀 보고.
Introduction
신경 과학의 주요 목표는 정보 회로 통해 흐르는 하는 방법을 이해 하는 뉴런 사이의 연결을 매핑합니다. 수많은 접근 및 자원 모델 시스템1,2의 범위에서 신경 사이의 기능적 연결을 위한 테스트를 사용할 수 있게 있다. 전기 생리학을 사용 하 여 가장 정확한 배선 다이어그램을 생성 하기 위해 두 셀 사이의 관찰된 연결 인지 직접 및 간접 및 polysynaptic monosynaptic를 해결 하기 위해 중요 하다. 포유류 뉴런에이 구별을 만들기 위한 황금 표준 연 접 세포에서 단일 action potentials와 두 번째 뉴런 흥분 성의 postsynaptic 전류 (EPSCs)의 발병 사이의 대기 시간을 측정 하는 것입니다. Monosynaptic 연결 몇 밀리초 및 낮은 다양성3의 짧은 대기 시간을 가져야 한다. 이 방법은 복잡할 수 있다 무척 추 동물 신경 세포에 시 냅 스 탐지 postsynaptic conductances와 녹음 사이 긴 electrotonic 거리 때문에 지연을 일으키는 체세포 녹음 사이트까지 그들의 dendrites에서 발생할 수 있기 때문에 전극입니다. 이러한 지연을 모호성에 관한 많은-monosynaptic 기여 대 발생할 수 있습니다. 또한, 작은 시 냅 스 이벤트 체세포 녹음 사이트에 도달 하기 전에 부패 수 있습니다 하 고 polysynaptic 이벤트를 모집 하는 강한 연 접 활동, 운전.
무척 추 동물에 monosynaptic 연결에 대 한 테스트를 다양 한 기법 개발 되었습니다. 한 가지 방법은 초과 ++ Mg 및 Ca+ +를 포함 하는 높은 divalent 양이온 솔루션 (안녕-디)를 사용 합니다. 이 솔루션 줄이는 릴리스 확률 및 monosynaptic 입력된4,5의 탐지를 증가 활동 전위 임계값에 의해 polysynaptic 연결을 차단 합니다. 하지만 필요한 ca ++ ++ Mg의 정확한 비율을 결정, 사소한 이며 polysynaptic 기부금도 겸손 자극6지속 될 수 있습니다. GFP 재구성에서 시 냅 스 파트너 (이해) 라는 다른 접근은 monosynaptic 연결 7을 유추 시 냅 스에서 발견 하는 사전 및 postsynaptic 막 간의 근접 합니다. 여기, 녹색 형광 단백질 (GFP)의 구성 요소는 하나의 신경에 표현 하 고 분자의 상호 보완적인 조각 putative postsynaptic 파트너에 표시 됩니다. 형광의 존재 두 개의 뉴런 충분히 가까이에 GFP 분자의 재구성을 허용 하는 한 시 냅 스의 존재를 의미 나타냅니다. 이해 수 보고 시 냅 스 거짓, 하지만, 두 세포 막, 신경 또는 잘라냅니다 apposed 밀접 하 게 해야 하는 경우. 이해의 변종 활성 시 냅 스8에 재구성 되므로 synaptobrevin 직접 GFP의 연 접 부분을 밧줄로 매 여 이러한 가양성을 제거 합니다. 이해 및 그 변종 초파리 CNS 기능 연결을 결정 하는 수단이 되어, 하는 동안 일부 연결 하지 만들 수 있습니다 보이는 파악 하 여 사전 및 postsynaptic 파트너 사이의 거리는 비교적 큰 경우. 이것은 neuromodulation9 또는 GABAergic 억제10와 관련 된 볼륨 전송의 평가에 특히 관련입니다.
여기, 보완 및 새로운 기술은 초파리 CNS에에서 직접 monosynaptic 연결 테스트에 대 한 시연입니다. 테트로도톡신 (TTX)의 공동 식으로 작동 하는이 메서드를 테트로도톡신 설계 저항에 대 한 프로 빙 Synapses (TERPS),-저항 나트륨 채널, NaChBac, 및 상 상속에서 녹음 하는 동안 연 접 세포에서 optogenetic 활성 postsynaptic 파트너9. TTX, 존재 모든 활동 전위 중재 활동 NaChBac 표현 된 셀에 표시 되지 않습니다. NaChBac 채널 선택적으로 허용 하는 시 냅 스 전송 빛 갖는 대상된 연 접 셀에 흥분을 복원 합니다. 이 메서드는 연결 postsynaptically polysynaptic 회로 채용의 가능성을 줄이면서 체세포 녹음 하 여 해결할 수 연 접 신경의 강한 활성화를 허용 합니다. 중요 한 것은,이 기술은 볼륨 전송의 연구를 허용 하 고 회로 통해 하나의 신경에서 발표 하는 송신기의 확산을 보여준다. 또한, TERPS 기존의 약리학 통해 연결의 화학 본질을 밝힐 수 있다. TERPS는 TTX 구분 나트륨 수로의 유전자 변형 식 수 있도록 어떤 모델 시스템에 사용 하기 위해 적합 이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
TERPS 분석 회로 확인 된 신경 세포 사이의 시 냅 스의 검출 함으로써 크래킹에 사용 되는 현재 기술을 칭찬. 특히, 접근 선택 인구 TTX 구분 나트륨 채널 NaChBac 신경의 흥분을 복원 하는 동안 TTX와 활동 전위를 광범위 하 게 입을 여 monosynaptic 연결을 보여준다. 시 냅 스 릴리스 postsynaptic 이벤트는 전체 셀 녹음과 모니터링 하는 동안 optogenetic 자극에 의해 elicited입니다. TERPS 대량 민감한 되 고 또는 더 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 의견에 대 한 사려깊은 검토 뿐만 아니라 여호수아가 수, 조나단 Schenk, 원고에 감사 하 고 싶습니다. 우리 또한 벤 화이트와 해 롤 드 Zakon는 기술에 대 한 토론에 감사 하 고 싶습니다. 조나단 Schenk 그림 3A에 대 한 데이터를 제공합니다. 이 작품은 Whitehall 재단 보조금과 QG NIH R21에 의해 지원 되었다.
Materials
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 – 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block – BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
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