Examinant les connexions monosynaptiques chez la drosophile en utilisant des canaux sodiques tétrodotoxine résistant
Summary
Cet article propose une méthode pour tester les connexions monosynaptiques entre neurones en employant la tétrodotoxine et canal sodique résistant à la tétrodotoxine, NaChBac.
Abstract
Ici, une nouvelle technique appelée Tetrotoxin (TTX) Engineered résistance des Synapses à sonder (TERPS) est appliquée pour tester la monosynaptiques connexions entre les neurones de la cible. La méthode s’appuie sur la co-expression d’un activateur transgénique avec canal sodique résistant à la tétrodotoxine, NaChBac, dans un neurone présynaptique spécifique. Connexions avec les partenaires post-synaptiques putatifs sont déterminées par cellule entière enregistrements en présence de TTX, qui bloque l’activité électrique dans les neurones qui n’expriment pas de NaChBac. Cette approche peut être modifiée pour fonctionner avec un activateur ou imagerie calcique comme journaliste de connexions. TERPS ajoute à l’ensemble croissant des outils disponibles pour déterminer la connectivité au sein des réseaux. Cependant, les TERPS est unique en ce qu’elle rapporte aussi fiable en masse ou volume et transmission de débordement.
Introduction
Un objectif majeur des neurosciences consiste à mapper les connexions entre les neurones pour comprendre comment l’information circule à travers des circuits. Nombreuses approches et les ressources sont devenues disponibles pour tester la connectivité fonctionnelle entre les neurones dans une gamme de systèmes de modèle1,2. Pour générer les schémas de câblage plus précis à l’aide d’électrophysiologie, il est important de résoudre si connexions observées entre deux cellules sont directs et monosynaptique versus indirecte et polysynaptiques. Un étalon-or pour faire cette distinction dans les neurones chez les mammifères est de mesurer la latence entre unique action potentials dans les cellules présynaptiques et l’apparition de courants postsynaptiques excitateurs (EPSCs) dans le deuxième neurone. Connexions monosynaptiques devraient avoir courts temps de latence de quelques millisecondes et faible variabilité3. Cette approche peut être compliquée dans les neurones d’invertébrés comme les synapses peuvent être chez leurs dendrites loin du site d’enregistrement somatique, provoquant des retards dans la détection en raison des distances longues électrotonique entre conductances postsynaptiques et l’enregistrement électrode. Ces retards peuvent introduire des ambiguïté concernant poly-par rapport aux cotisations monosynaptiques. En outre, petits événements synaptiques peut se désintégrer avant d’atteindre le site d’enregistrements somatique et conduire plus forte activité présynaptique, est susceptibles de recruter des événements polysynaptiques.
Diverses techniques ont été développés pour tester les connexions monosynaptiques chez les invertébrés. Une approche utilise des solutions de haute cation divalent (Hi-Di) contenant des excès de Mg++ et Ca++. Cette solution bloque les connexions polysynaptiques par probabilité de libération réductrice et croissant seuil de potentiel d’action pour favoriser la détection de monosynaptique entrée4,5. Déterminer le rapport précis entre la Mg++ ca++ nécessaire, cependant, n’est pas trivial et polysynaptiques contributions peuvent persister pendant une stimulation même modeste6. Une approche alternative appelée Reconstitution GFP entre partenaires synaptiques (GRASP) profite de la proximité entre les membranes préalables et postsynaptiques trouvé au niveau des synapses d’inférer une connexion monosynaptique 7. Ici, une composante de la protéine fluorescente verte (GFP) s’exprime dans un neurone, et le fragment complémentaire de la molécule est exprimé dans un partenaire postsynaptique putatif. La présence de fluorescence indique que les deux neurones sont très suffisamment proches pour permettre la reconstitution de la molécule GFP et implique l’existence d’une synapse. GRASP peut signaler les synapses faussement, cependant, si deux cellules ont étroitement accolées des membranes, comme dans un nerf ou fascicules. Variantes du GRASP éliminent ces faux positifs en attachant le fragment présynaptique de GFP directement à synaptobrévine, permettant ainsi la reconstitution qu’au synapses actives8. Tandis que le GRASP et ses variantes ont grandement contribués à établir la connectivité fonctionnelle chez la drosophile CNS, certaines connexions ne peuvent pas rendues visibles par emprise si les distances entre les partenaires de pré- et post-synaptiques est relativement importante. Ceci est particulièrement pertinent dans l’évaluation de la transmission de volume associée à la neuromodulation9 ou de l’inhibition GABAergique10.
Ici, une technique nouvelle et complémentaire est démontrée pour tester les connexions directes de monosynaptiques chez la drosophile CNS. Cette méthode, appelée tétrodotoxine Engineered résistance pour sonder Synapses (TERPS), fonctionne par la co-expression de la tétrodotoxine (TTX)-canal sodique résistant, NaChBac et un activateur d’optogenetic dans une cellule présynaptique pendant l’enregistrement de putatif partenaires postsynaptique9. En présence de TTX, toute l’activité induite par le potentiel d’action est supprimée dans les cellules autres que celles exprimant NaChBac. Le canal de NaChBac restaure sélectivement excitabilité dans les cellules présynaptiques ciblées, permettant la transmission synaptique évoquée par la lumière. Cette méthode permet de forte activation des neurones présynaptiques, telles que les connexions peuvent être résolues postsynaptique par somatique enregistrement tout en réduisant la probabilité de recrutement circuits polysynaptiques. Ce qui est important, cette technique permet l’étude de la transmission de volume et révèle la propagation du transmetteur libéré d’un neurone unique tout au long d’un circuit. En outre, les TERPS peut révéler la nature chimique de la connexion par le biais de pharmacologie traditionnelle. TERPS est adapté pour une utilisation dans n’importe quel système de modèle qui permet l’expression transgénique des canaux de sodium insensibles à la TTX.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analyse de la TERPS complimente les techniques actuelles utilisées pour circuit fissuration en permettant la détection des synapses entre les neurones. Plus précisément, l’approche indique monosynaptiques connexions par largement faire taire les potentiels d’action avec TTX tout en rétablissant l’excitabilité dans une population de sélectionner des neurones avec canal sodique insensibles à la TTX NaChBac. Libération synaptique est induite par la stimulation de l’optogenetic, tandis que les événements p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Joshua Singer, Jonathan Schenk, ainsi que réfléchies évaluateurs pour commentaires sur le manuscrit. Nous tenons également à remercier Ben White et Harold Zakon pour des discussions sur la technique. Jonathan Schenk a fourni les données de la Figure 3 a. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation de Whitehall et une R21 NIH au QG.
Materials
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 – 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block – BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
Riferimenti
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