Questo articolo presenta un metodo per verificare le connessioni monosinaptica tra neuroni impiegando tetrodotossina e il canale del sodio tetrodotossina-resistente, NaChBac.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Esaminando monosinaptica connessioni in Drosophila utilizzando i canali di sodio tetrodotossina resistenti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Qui, una nuova tecnica chiamata Tetrotoxin (TTX) Engineered resistenza per sondare le sinapsi (TERPS) viene applicata per verificare monosinaptica connessioni tra i neuroni bersaglio. Il metodo si basa sulla co-espressione di un attivatore transgenico con il canale del sodio tetrodotossina-resistente, NaChBac, in un neurone presinaptico specifico. Connessioni con presunto partner post-sinaptico sono determinate dalle cellule intere registrazioni in presenza di TTX, che blocca l'attività elettrica nei neuroni che non esprimono NaChBac. Questo approccio può essere modificato per funzionare con qualsiasi attivatore o l'imaging del calcio come un reporter di connessioni. TERPS aggiunge il set crescente di strumenti disponibili per determinare la connettività all'interno di reti. Tuttavia, TERPS è unico in quanto segnala anche attendibilmente massa o volume trasmissione e trasmissione di spillover.
Introduzione
Degli obiettivi principali delle neuroscienze è quello di mappare le connessioni tra i neuroni a comprendere il fluiscono di informazioni attraverso circuiti. Numerosi approcci e risorse sono diventati disponibili per testare la connettività funzionale tra neuroni in una gamma di sistemi modello1,2. Per generare gli schemi di collegamento più precisi utilizzando elettrofisiologia, è importante risolvere se osservate connessioni tra due cellule sono diretti e monosinaptica versus indiretto e polisinaptici. Un gold standard per fare questa distinzione nei neuroni dei mammiferi è di misurare la latenza tra singol....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. preparare mosche e identificare GAL4 promotore linee
- Selezionare una linea di promotore GAL4 e attraversarlo con mosche che trasportano il transgene UAS-NaChBac sia un transgene optogenetica per l'attivazione.
Nota: UAS-CsChrimson11 è selezionata a causa della sua alta conduttanza e la facilità con cui si attiva NaChBac-mediata dei potenziali di azione. UAS-NaChBac sia UAS-CsChrimson sono disponibili dal Repository di scorte di Bloomington. - Preparare tutto-trans retinico come una soluzione in etanolo (35 mM) e conservare la soluzione in congelatore a-20 ° C.
- µ L di mix 28 di questo stock in circa 5 mL di pata....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
TERPS è utilizzato per distinguere tra mono - e polisinaptici contributi in connessioni sinaptiche tra i neuroni. Mentre la stimolazione debole di una cella può essere utilizzata per verificare le connessioni dirette, guidando una maggiore attività presinaptiche spesso reclute polisinaptici connessioni (Figura 1A). TERPS funziona cheesprimono il canale del sodio TTX-insensibile NaChBac e un attivatore di optogenetica e test delle connessioni in presenza di TT.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Analisi TERPS complimenti attuale tecniche utilizzate per circuito cracking attivando il rilevamento delle sinapsi tra neuroni identificati. In particolare, l'approccio rivela connessioni monosinaptica largamente silenziamento potenziali di azione con TTX durante il ripristino di eccitabilità in una popolazione di seleziona dei neuroni con il canale del sodio TTX-insensibile NaChBac. Rilascio sinaptico è tratta da stimolo optogenetica mentre eventi postsinaptici sono monitorati con cellule intere registrazioni. TERPS si .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Joshua Singer, Jonathan Schenk, come pure gli ospiti premurosi per i commenti sul manoscritto. Vorremmo anche ringraziare Ben White e Harold Zakon per discussioni sulla tecnica. Jonathan Schenk ha fornito i dati per la Figura 3A. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della Fondazione Whitehall e un R21 NIH al QG.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Utilizzato come attivatore neurale |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores eccitabilità nelle cellule in TTX |
| Tetrodotossina | Tochris | 1078 | Potrebbe essere necessaria un'autorizzazione speciale per l'acquisto di TTX in quanto è una sostanza controllata |
| tutta trans-retinica | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Richiede co-fattore per la canalrodopsina |
| Acciaio inossidabile 321 saldabile Foglio, 0,002" Spesso, 10" | Largo McMaster Carr | 3254K7 | Utilizzato per realizzare portamosche personalizzato. La pellicola personalizzata può essere tagliata al laser a pololu.com dal file PDF fornito |
| Microscopio di dissezione | Zeiss | Stemi 2000-C | Utilizzato per la dissezione della preparazione |
| Cera | Almore | Eectra Waxer 66000 | Utilizzato durante la dissezione per fissare la mosca in lamina |
| Cera di paraffina | Joann | 4917217 Utilizzato con la | |
| ceratrice Numero 5 pinze | Strumenti per la scienza | #5CO | Utilizzato per la dissezione e la guaina |
| Forbici da dissezione | Strumenti per la scienza fine | 15001-08 | Utilizzato per rimuovere parti della cuticola durante la dissezione |
| Filo di tungsteno | A-M Systems | 797500 | Utilizzare con l'elettrolisi per realizzare aghi affilati per la dissezione |
| Pompa peristaltica circolante | Pompe semplicemente (Amazon) | PM200S | per il ricircolo TTX |
| Regolatore di velocità per pompa peristaltica | Zitrades (Amazon) | N / A | PWM per luci a LED o nastro, 12 Volt 8 Amp, interruttore luce a luminosità regolabile Dimmer Controller DC12V 8A 96W per striscia luminosa a led B |
| Versa-Mount Regolatore di aria compressa di precisione | McMaster Carr | 1804T1 | Per l'applicazione di una pressione positiva durante il patching |
| Capilari in vetro | Precision Instruments | TW150F-3 | Per pipette per patch |
| Manometro multiuso | McMaster Carr | 3846K431 | Manometro per regolatore |
| di pressione Elettrofisiologia Camera | Dage MTI | IR-1000 | Qualsiasi telecamera che funzioni nella gamma IR (850 nm) funzionerà. Non si desidera utilizzare l'illuminazione rossa in quanto ciò può attivare csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | Per fibra ottica di illuminazione obliqua |
| per IR LED | Thorlabs | M89L01 | Coppie a IR |
| LED Obiettivo lente | Olympus 40X | LUMPlanFLN | Può essere utilizzato sulla maggior parte delle microscienze e funziona bene per la visualizzazione dei neuroni delle mosche. |
| LED ambra | Thorlabs | M590L3d | Per la visualizzazione di RFP e |
| mCherry Blue LED | Thorlabs | M470L3d | Per la visualizzazione del |
| GFP Chroma | 49011 | Per la visualizzazione di GFP o la stimolazione del canale2rodopsina | |
| Set di filtri mCherry personalizzato | Chroma | ET580/25X e T600LPXR (dal set 49306) ma con un'ottica di barriera/emissione ET610LP | Utilizzare solo se si desidera applicare patch ai neuroni identificati con channel2rhodopsin |
| Dichroic per combinare LED ambra e blu | Thorlabs DMLP550R | Utilizzare solo il cerotto sotto mCherry ed eccitare channel2rhodopsin con luce blu. | |
| rossi | LEDSupply | Cree XPE 620 - 630 nm | Utilizzato per pilotare csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Utilizzato per pilotare LED per stimolazione optogenetica |
| Manipolatore | Sutter Instruments | MP-225 | Utilizzato per posizionare la pipetta durante le registrazioni |
| Amplificatore Patchclamp | A-M Systems | Modello 2400 | È adatto |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Filtro ausiliario utilizzato per filtrare la traccia di corrente all'oscilloscopio durante il patching. |
| Sistema di acquisizione dati | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Utilizzato per registrare dati dall'amplificatore al computer |
| Blocco connettore - Terminale BNC BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Utilizzato per collegare l'amplificatore alla scheda DAQ. |
| Lamina d'acciaio | McMaster Carr | 3254K7 | Lamina d'acciaio per camera di registrazione personalizzata |
| Magneti | K& J Magnetics | D42 | Per fissare la camera di registrazione al supporto ad anello |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Utilizzato per realizzare una camera di registrazione personalizzata. L'acrilico può essere tagliato al laser con pololu.com dal file PDF fornito |
Riferimenti
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal con....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
