Tetrodotoxin प्रतिरोधी सोडियम चैनलों का उपयोग Drosophila में Monosynaptic कनेक्शन की जांच
Summary
यह आलेख tetrodotoxin और tetrodotoxin-प्रतिरोधी सोडियम चैनल, NaChBac को नियोजित करके न्यूरॉन्स के बीच monosynaptic कनेक्शन का परीक्षण करने के लिए एक विधि सुविधाएँ.
Abstract
यहां, एक नई तकनीक Tetrotoxin (TTX) जांच के लिए इंजीनियर प्रतिरोध Synapses (TERPS) के लिए लक्ष्य ंयूरॉंस के बीच monosynaptic कनेक्शन के लिए परीक्षण के लिए आवेदन किया है । विधि सह पर निर्भर करता है, एक विशिष्ट presynaptic ंयूरॉन में tetrodotoxin प्रतिरोधी सोडियम चैनल, NaChBac, के साथ एक ट्रांसजेनिक उत्प्रेरक की अभिव्यक्ति । ख्यात पोस्ट के साथ कनेक्शन-synaptic भागीदारों TTX की उपस्थिति में पूरे सेल रिकॉर्डिंग द्वारा निर्धारित कर रहे हैं, जो NaChBac व्यक्त नहीं करते कि न्यूरॉन्स में विद्युत गतिविधि ब्लॉक. इस दृष्टिकोण को किसी भी उत्प्रेरक या कनेक्शन के एक रिपोर्टर के रूप में कैल्शियम इमेजिंग के साथ काम संशोधित किया जा सकता है । TERPS नेटवर्क के भीतर कनेक्टिविटी निर्धारित करने के लिए उपलब्ध उपकरणों के बढ़ते सेट को जोड़ता है । हालांकि, TERPS कि यह भी मज़बूती से थोक या वॉल्यूम ट्रांसमिशन और spillover ट्रांसमिशन रिपोर्ट में अद्वितीय है ।
Introduction
तंत्रिका विज्ञान के एक प्रमुख लक्ष्य को समझने के लिए कैसे जानकारी सर्किट के माध्यम से बहती ंयूरॉंस के बीच कनेक्शन नक्शा है । कई दृष्टिकोण और संसाधनों के लिए मॉडल सिस्टम1,2की एक श्रेणी में ंयूरॉंस के बीच कार्यात्मक संपर्क के लिए परीक्षण उपलब्ध हो गए हैं । इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग कर सबसे सटीक तारों आरेख उत्पन्न करने के लिए, यह दो कोशिकाओं के बीच मनाया कनेक्शन प्रत्यक्ष और monosynaptic बनाम अप्रत्यक्ष और polysynaptic हैं कि क्या हल करने के लिए महत्वपूर्ण है. स्तनधारी न्यूरॉन्स में इस अंतर को बनाने के लिए एक सोने के मानक presynaptic कोशिकाओं में एकल कार्रवाई क्षमता के बीच विलंबता को मापने और उत्तेजक postsynaptic धाराओं (EPSCs) की शुरुआत में दूसरे ंयूरॉन. Monosynaptic कनेक्शंस में कुछ मिलीसेकंड और कम परिवर्तनशीलता3की लघु विलंब होनी चाहिए । यह दृष्टिकोण invertebrate न्यूरॉन्स में जटिल हो सकता है क्योंकि synapses उनके dendrites तक दैहिक रिकॉर्डिंग साइट से हो सकता है, postsynaptic conductances और रिकॉर्डिंग के बीच लंबी electrotonic दूरी की वजह से पता लगाने में देरी के कारण इलेक्ट्रोड. इस तरह की देरी पाली बनाम monosynaptic योगदान के बारे में अस्पष्टता का परिचय कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, दैहिक रिकॉर्डिंग साइट तक पहुंचने से पहले छोटे synaptic घटनाओं क्षय हो सकता है, और मजबूत presynaptic गतिविधि ड्राइविंग, polysynaptic घटनाओं की भर्ती होने की संभावना है ।
अकशेरूकीय में monosynaptic कनेक्शन के लिए परीक्षण के लिए विभिन्न तकनीकों को विकसित किया गया है । एक दृष्टिकोण उच्च divalent कटियन समाधान (हाय-Di) अतिरिक्त मिलीग्राम+ + और सीए+ +युक्त का उपयोग करता है । यह समाधान monosynaptic इनपुट4,5का पता लगाने के पक्ष में रिलीज़ प्रायिकता को कम करने और कार्रवाई संभावित थ्रेशोल्ड को बढ़ाने से polysynaptic कनेक्शन ब्लॉक करता है । मिलीग्राम की सटीक अनुपात का निर्धारण+ + करने के लिए सीए ++ आवश्यक, तथापि, तुच्छ नहीं है और polysynaptic योगदान भी मामूली उत्तेजना6के लिए बनी रह सकती है. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण Synaptic भागीदारों भर में GFP पुनर्गठन कहा जाता है (समझ) पूर्व के बीच निकटता का लाभ लेता है और postsynaptic झिल्ली synapses में पाया एक monosynaptic कनेक्शन 7का अनुमान है । यहां, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक घटक (GFP) एक ंयूरॉन में व्यक्त की है, और अणु के पूरक टुकड़ा एक ख्यात postsynaptic साथी में व्यक्त की है । प्रतिदीप्ति की उपस्थिति इंगित करता है कि दो न्यूरॉन्स करीब पर्याप्त निकटता में हैं GFP अणु के पुनर्गठन की अनुमति और एक synapse के अस्तित्व का तात्पर्य. समझ synapses झूठी रिपोर्ट कर सकते हैं, हालांकि, अगर दो कोशिकाओं को बारीकी से apposed झिल्ली है, के रूप में एक तंत्रिका या fascicle में । समझ के वेरिएंट synaptobrevin करने के लिए सीधे GFP के presynaptic टुकड़ा tethering द्वारा इस तरह के झूठे सकारात्मक को खत्म करने, इस प्रकार केवल सक्रिय synapses8पर पुनर्गठन की अनुमति । जबकि समझ और उसके वेरिएंट में कार्यात्मक संपर्क का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है Drosophila सीएनएस, कुछ कनेक्शन नहीं किया जा सकता दिखाई समझ से अगर पूर्व और postsynaptic भागीदारों के बीच दूरी अपेक्षाकृत बड़ी है । यह neuromodulation9 या GABAergic संकोच10के साथ जुड़े मात्रा संचरण के आकलन में विशेष रूप से प्रासंगिक है ।
यहां, एक पूरक और उपंयास तकनीक Drosophila सीएनएस में प्रत्यक्ष monosynaptic कनेक्शन के परीक्षण के लिए प्रदर्शन किया है । इस विधि, Synapses (TERPS) की जांच के लिए Tetrodotoxin इंजीनियर प्रतिरोध कहा जाता है, सह द्वारा काम करता है Tetrodotoxin की अभिव्यक्ति (TTX)-प्रतिरोधी सोडियम चैनल, NaChBac, और एक optogenetic कक्ष में एक presynaptic उत्प्रेरक जबकि ख्यात से रिकॉर्डिंग postsynaptic पार्टनर्स9. TTX की उपस्थिति में, सभी कार्रवाई संभावित मध्यस्थता गतिविधि उन NaChBac व्यक्त करने के अलावा अन्य कोशिकाओं में दबा दिया है. NaChBac चैनल चुनिंदा लक्षित presynaptic सेल (ओं) में उत्तेजित पुनर्स्थापित करता है, प्रकाश-synaptic संचरण की अनुमति । इस विधि presynaptic ंयूरॉंस की मजबूत सक्रियण परमिट, इस तरह कि कनेक्शन दैहिक रिकॉर्डिंग द्वारा postsynaptically हल किया जा सकता है, जबकि polysynaptic सर्किट भर्ती की संभावना को कम करने । महत्वपूर्ण बात, इस तकनीक की मात्रा संचरण के अध्ययन परमिट और एक सर्किट भर में एक ंयूरॉन से जारी ट्रांसमीटर के प्रसार से पता चलता है । इसके अलावा, TERPS पारंपरिक औषध विज्ञान के माध्यम से कनेक्शन की रासायनिक प्रकृति प्रकट कर सकते हैं । TERPS किसी भी मॉडल प्रणाली है कि TTX असंवेदनशील सोडियम चैनलों की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति की अनुमति देता में उपयोग के लिए उपयुक्त है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
TERPS विश्लेषण तारीफ वर्तमान तकनीक की पहचान न्यूरॉन्स के बीच synapses का पता लगाने को सक्षम करने के द्वारा खुर सर्किट के लिए इस्तेमाल किया. विशेष रूप से, दृष्टिकोण TTX-असंवेदनशील सोडियम चैनल NaChBac के साथ न्यूरॉन्स ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम यहोशू गायक, जोनाथन Schenk, साथ ही पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए विचारशील समीक्षक शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम भी बेन व्हाइट और हेरोल्ड Zakon तकनीक पर विचार विमर्श के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । जोनाथन Schenk चित्रा 3ए के लिए डेटा प्रदान की है । यह काम एक व्हाइटहॉल फाउंडेशन ग्रांट और QG के लिए एक NIH R21 द्वारा समर्थित था ।
Materials
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 – 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block – BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
Riferimenti
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