Att undersöka Monosynaptic anslutningar i Drosophila använda Tetrodotoxin resistenta natriumkanaler
Summary
Denna artikel innehåller en metod för att testa monosynaptic kopplingarna mellan nervceller genom att anställa tetrodotoxin och tetrodotoxin-resistenta natrium kanal, NaChBac.
Abstract
Här, används en ny teknik som kallas Tetrotoxin (TTX) konstruerade motstånd för sondering synapser (TERPS) för att testa för monosynaptic anslutningar mellan målet nervceller. Metoden bygger på samtidig uttryck av en transgen aktivator med tetrodotoxin-resistenta natrium kanal, NaChBac, i en specifik presynaptiska neuron. Anslutningar med förmodad efter synaptic partners bestäms av hela-cell inspelningar i närvaro av TTX, som blockerar elektrisk aktivitet i nervceller som inte uttrycker NaChBac. Detta tillvägagångssätt kan ändras för att fungera tillsammans med aktivator eller kalcium imaging som reporter av anslutningar. TERPS läggs till den växande uppsättningen verktyg tillgängliga för att fastställa anslutning inom nätverk. TERPS är dock unikt i att det rapporterar också tillförlitligt bulk- eller volym överförings- och spridningseffekter överföring.
Introduction
Ett viktigt mål för neurovetenskap är att kartlägga sambanden mellan nervceller att förstå hur information flödar genom kretsar. Många metoder och resurser har blivit tillgängliga för funktionella anslutningstestet mellan nervceller i en rad modell system1,2. För att generera de noggrannaste kopplingsscheman använder elektrofysiologi, är det viktigt att lösa om observerade sambanden mellan två celler är direkta och monosynaptic kontra indirekta och polysynaptic. En guld-standard för att göra denna distinktion i däggdjur nervceller är att mäta latensen mellan enstaka action potentials i presynaptiska cellerna och uppkomsten av excitatoriska postsynaptiska strömmar (EPSCs) i andra neuron. Monosynaptic anslutningar bör ha kort latens i några millisekunder och låg variabilitet3. Detta tillvägagångssätt kan vara komplicerat i ryggradslösa nervceller eftersom synapser kan förekomma i deras dendriter långt ifrån den somatiska inspelning webbplats, orsakar förseningar i upptäckt tack vare lång electrotonic distanserar mellan postsynaptiska conductances och inspelningen elektroden. Sådana förseningar kan införa tvetydighet om poly-kontra monosynaptic bidrag. Dessutom små synaptic evenemang kan förfalla innan du når webbplatsen somatiska inspelningar och körning starkare presynaptiska aktivitet, sannolikt att rekrytera polysynaptic händelser.
Olika tekniker har utvecklats för att testa för monosynaptic anslutningar i ryggradslösa djur. En strategi använder hög tvåvärda ering lösningar (Hi-Di) som innehåller överflödiga Mg++ och Ca++. Denna lösning blockerar polysynaptic anslutningar genom att minska release sannolikheten och ökande aktionspotential tröskeln att gynna upptäckten av monosynaptic input4,5. Fastställa det exakta förhållandet mg++ till Ca++ krävs, är dock inte trivialt och polysynaptic bidrag kan kvarstå för även en blygsam stimulering6. En alternativ metod som kallas GFP beredning över Synaptic Partners (grepp) drar nytta av närheten mellan pre- och postsynaptiska membran finns på synapser att härleda en monosynaptic anslutning 7. Här, en komponent av grönt fluorescerande protein (GFP) uttrycks i en nervcell, och den kompletterande fragmentet av molekylen uttrycks i en förmodad postsynaptiska partner. Förekomsten av fluorescens visar att de två nervcellerna i nära nog närhet att möjliggöra beredning av GFP molekylen och antyder existensen av en synaps. GREPP kan rapportera synapser falskt, dock om två celler har nära apposed membran, som i en nerv eller frånskilja. Varianter av grepp eliminera sådana falska positiva genom tjudra den presynaptiska fragmentet av GFP direkt till synaptobrevin, vilket möjliggör beredning endast på aktiva synapser8. Medan grepp och dess varianter har varit avgörande för att fastställa funktionella anslutningar i den Drosophila CNS, kan vissa anslutningar inte göras synlig av grepp om avstånden mellan pre- och postsynaptiska partners är relativt stor. Detta är särskilt relevant för bedömningen av volym överföring är associerad med neuromodulation9 eller GABAergic hämning10.
Här demonstreras en kompletterande och ny teknik för att testa monosynaptic direktförbindelser i Drosophila CNS. Denna metod, som kallas Tetrodotoxin konstruerade motstånd för sondering synapser (TERPS), fungerar genom samtidig uttryck av tetrodotoxin (TTX)-resistenta natrium kanal, NaChBac och en optogenetic aktivator i en presynaptiska cellen under inspelning från förmodade postsynaptiska partners9. I närvaro av TTX dämpas all potentiell handling-medierad aktivitet i celler än de som uttrycker NaChBac. Den NaChBac kanalen återställer selektivt retbarhet i den riktade presynaptiska cell(er) tillåter ljus-framkallat synaptisk transmission. Denna metod tillåter stark aktivering av de presynaptiska neuronerna, sådan att anslutningar kan lösas postsynaptically genom somatiska inspelning samtidigt minska sannolikheten för att rekrytera polysynaptic kretsar. Viktigast av allt, denna teknik tillåter studier av volym överföring och avslöjar spridningen av sändare som frigörs från en enda neuron i hela en krets. TERPS kan dessutom avslöja kemiska beskaffenhet anslutning via konventionell farmakologi. TERPS är lämplig för användning i alla modellsystem som tillåter transgena uttrycket av TTX-okänsliga natriumkanaler.
Protocol
Representative Results
Discussion
TERPS analys komplimanger aktuella tekniker som används för krets sprickbildning genom att aktivera upptäckt av synapser mellan identifierade nervceller. Specifikt avslöjar metoden monosynaptic anslutningar av i stort sett ljuddämpningssystem handlingspänningar med TTX samtidigt återställa retbarhet i en Välj population av nervceller med TTX-okänsliga natrium kanal NaChBac. Synaptic release framkallas genom optogenetic stimulering medan postsynaptiska händelser övervakas med hela-cell inspelningar. TERPS skil…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Joshua Singer, Jonathan Schenk, samt eftertänksamma recensioner för synpunkter på manuskriptet. Vi vill också tacka Ben White och Harold Zakon för diskussioner på tekniken. Jonathan Schenk lämnade uppgifterna för figur 3A. Detta arbete stöds av en Whitehall Foundation Grant och en NIH R21 till QG.
Materials
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 – 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block – BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
Riferimenti
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. , 684-696 (2012).
- Doyle, M. W., Andresen, M. C. Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro. J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).
- Nicholls, J. G., Purves, D. Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech. J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).
- Liao, X., Walters, E. T. The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia. J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).
- Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, 353-363 (2008).
- Macpherson, L. J., et al. Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation. Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).
- Zhang, X., Gaudry, Q. Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe. Elife. 5, (2016).
- Wilson, R. I. Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles. Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11, 338-346 (2014).
- Murthy, M., Turner, G. C. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).
- Murthy, M., Turner, G. C. Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).
- Gu, H., O’Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J Vis Exp. , (2007).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
- Kazama, H., Wilson, R. I. Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses. Neuron. 58, 401-413 (2008).
- Becnel, J., et al. DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly. Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).
- Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions. PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).
- Holloway, B. B., et al. Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice. J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
- Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta. J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).
- Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap. Genesis. 39, 240-245 (2004).
