Undersøge Monosynaptic forbindelser i Drosophila ved hjælp af Tetrodotoxin resistente natrium kanaler
Summary
Denne artikel indeholder en metode til at teste de monosynaptic forbindelser mellem neuroner ved hjælp af tetrodotoxin og tetrodotoxin-resistente natrium kanalen, NaChBac.
Abstract
Her, er en ny teknik, der kaldes Tetrotoxin (TTX) udviklet resistens over for sondering synapser (TERPS) anvendt til at teste for monosynaptic forbindelser mellem target neuroner. Metoden bygger på fælles udtryk for en transgene aktivator med tetrodotoxin-resistente natrium kanalen, NaChBac, i en bestemt præsynaptiske neuron. Forbindelser med formodede post synaptic partnere bestemmes af hele-celle optagelser i overværelse af TTX, som blokerer for elektriske aktivitet i neuroner, der ikke udtryk NaChBac. Denne tilgang kan ændres for at arbejde med alle aktivator eller calcium imaging som en reporter af forbindelser. TERPS tilføjer til den voksende sæt af værktøjer til rådighed til bestemmelse af tilslutningsmuligheder inden for netværk. TERPS er imidlertid unik, idet den rapporterer også pålideligt bulk eller mængde transmission og spillover transmission.
Introduction
Et vigtigt mål for neurovidenskab er at knytte forbindelser mellem neuroner til at forstå, hvordan information flyder gennem kredsløb. Adskillige strategier og ressourcer er blevet tilgængelig til test af funktionelle forbindelsen mellem neuroner i en række model systemer1,2. For at generere de mest præcise ledningsdiagrammer ved hjælp af Elektrofysiologi, er det vigtigt at løse om observerede forbindelser mellem to celler er direkte og monosynaptic versus indirekte og polysynaptic. En guld standard for at gøre denne skelnen i pattedyr neuroner er at måle latenstiden mellem enkelt action potentials i de præsynaptiske celler og udbrud af excitatoriske postsynaptiske strømme (EPSCs) i den anden neuron. Monosynaptic forbindelser skal have kort ventetid for et par millisekunder og lav variabilitet3. Denne tilgang kan være kompliceret i hvirvelløse neuroner, fordi synapser kan forekomme i deres dendritter langt fra webstedet somatiske optagelse, forårsager forsinkelser i registrering på grund af lange electrotonic afstande mellem postsynaptiske conductances og optagelsen elektrode. Sådanne forsinkelser kan indføre tvetydighed med hensyn til poly-versus monosynaptic bidrag. Derudover små synaptic begivenheder kan henfalde før de når webstedet somatiske optagelser, og køre stærkere præsynaptiske aktivitet, er tilbøjelige til at ansætte polysynaptic begivenheder.
Forskellige teknikker er blevet udviklet for at teste for monosynaptic forbindelser i hvirvelløse dyr. Én fremgangsmåde bruger høje divalent kation løsninger (Hi-Di) indeholdende overskydende Mg++ og Ca++. Denne løsning blokerer polysynaptic forbindelser ved at reducere sandsynligheden for udgivelse og stigende aktionspotentialet tærsklen til at favorisere påvisning af monosynaptic input4,5. Bestemmelse af det præcise forhold mellem Mg++ til Ca++ kræves, men er ikke trivielt og polysynaptic bidrag kan vare ved selv beskedne stimulation6. En alternativ metode kaldet normal god landbrugspraksis rekonstitution på tværs af Synaptic partnere (greb) udnytter nærhed mellem præ- og postsynaptiske membraner fundet på synapser at udlede en monosynaptic forbindelse 7. Her, en del af grøn fluorescerende proteiner (NGL) udtrykkes i en neuron, og den supplerende fragment af molekylet er udtrykt i en formodede postsynaptiske partner. Tilstedeværelsen af fluorescens viser, at de to neuroner er tæt nok på til at tillade rekonstituering af normal god landbrugspraksis molekyle og antyder eksistensen af en synapse. GREB kan rapportere synapser fejlagtigt, dog, hvis to celler har tæt apposed membraner, som i en nerve eller fascicle. Varianter af greb fjerne sådanne falske positiver af tethering den præsynaptiske fragment af normal god landbrugspraksis direkte til synaptobrevin, således at rekonstitution kun på aktive synapser8. Mens greb og dens varianter har været medvirkende til bestemmelse af funktionelle connectivity i Drosophila CNS, kan nogle forbindelser ikke gøres synlig ved greb hvis afstande mellem præ- og postsynaptiske partnere er relativt stor. Dette er særligt relevant i vurderingen af volumen transmission tilknyttet Neuromodulationsbehandling9 eller GABAergic hæmning10.
Her, er en supplerende og roman teknik påvist for at teste direkte monosynaptic forbindelser i Drosophila CNS. Denne metode, kaldet Tetrodotoxin manipuleret modstand for sondering synapser (TERPS), anlæg af co udtryk af tetrodotoxin (TTX)-resistente natrium kanal, NaChBac og en optogenetic activator i en præsynaptiske celle mens optagelse fra formodede postsynaptiske partnere9. I nærværelse af TTX, er alle aktionspotentialet-medieret aktivitet undertrykt i cellerne end de giver udtryk for NaChBac. NaChBac kanalen gendanner selektivt ophidselse i den målrettede præsynaptiske celler, tillader lys-fremkaldte synaptisk transmission. Denne metode tillader stærk aktivering af de præsynaptiske neuroner, således at forbindelser kan løses postsynaptically af somatiske optagelse samtidig reducere sandsynligheden for rekruttering polysynaptic kredsløb. Vigtigst, denne teknik tillader undersøgelse af volumen transmission og afslører spredning af senderen frigivet fra en enkelt neuron i et kredsløb. Derudover kan TERPS afsløre den kemiske natur for forbindelsen gennem konventionelle farmakologi. TERPS er egnet til brug i enhver modelsystem, der tillader den transgene udtryk for TTX-ufølsom natrium kanaler.
Protocol
Representative Results
Discussion
TERPS analyse komplimenter aktuelle teknikker bruges til kredsløb revner ved at aktivere påvisning af synapser mellem identificerede neuroner. Specifikt, afslører tilgangen monosynaptic forbindelser af bredt silencing handling potentialer med TTX mens gendannelse ophidselse i en udvalgt population af neuroner med TTX-ufølsom natrium kanalen NaChBac. Synaptic frigivelse er fremkaldt af optogenetic stimulation mens postsynaptiske begivenheder overvåges med hele-celle optagelser. TERPS adskiller sig fra andre metoder s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Joshua Singer samt Jonathan Schenk og tankevækkende korrekturlæsere for kommentarer på manuskriptet. Vi vil også gerne takke Ben White og Harold Zakon diskussioner om teknikken. Jonathan Schenk fastsatte figur 3Adata. Dette arbejde blev støttet af en Whitehall Foundation Grant og en NIH R21 til QG.
Materials
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 – 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block – BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
Riferimenti
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. , 684-696 (2012).
- Doyle, M. W., Andresen, M. C. Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro. J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).
- Nicholls, J. G., Purves, D. Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech. J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).
- Liao, X., Walters, E. T. The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia. J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).
- Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, 353-363 (2008).
- Macpherson, L. J., et al. Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation. Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).
- Zhang, X., Gaudry, Q. Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe. Elife. 5, (2016).
- Wilson, R. I. Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles. Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11, 338-346 (2014).
- Murthy, M., Turner, G. C. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).
- Murthy, M., Turner, G. C. Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).
- Gu, H., O’Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J Vis Exp. , (2007).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
- Kazama, H., Wilson, R. I. Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses. Neuron. 58, 401-413 (2008).
- Becnel, J., et al. DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly. Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).
- Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions. PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).
- Holloway, B. B., et al. Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice. J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
- Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta. J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).
- Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap. Genesis. 39, 240-245 (2004).
