Indagine della sintesi di RNA usando 5-Bromouridine di etichettatura e di immunoprecipitazione

Sommario

Questo metodo può essere utilizzato per misurare la sintesi del RNA. 5-Bromouridine è aggiunto alle cellule e integrare nel RNA sintetizzato. Sintesi di RNA viene misurata mediante estrazione di RNA immediatamente dopo la marcatura, seguita da 5-Bromouridine-mirati immunoprecipitazione di etichettati RNA e analisi di trascrizione inversa e reazione a catena della polimerasi quantitativa.

Abstract

Quando livelli allo stato stazionario del RNA sono confrontati fra due condizioni, non è possibile distinguere se i cambiamenti sono causati da alterazioni nella produzione o degradazione del RNA. Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione della produzione di RNA, usando 5-Bromouridine etichettatura di RNA seguito da immunoprecipitazione, che consente l'indagine di RNA sintetizzato entro un breve lasso di tempo (ad es., 1h). Il vantaggio di 5-Bromouridine-etichettatura e immunoprecipitazione sull'uso di inibitori trascrizionali tossici, come α-amanitina e actinomicina D, è che ci sono no o molto bassi effetti sulla vitalità cellulare durante l'uso a breve termine. Tuttavia, poiché 5-Bromouridine-immunoprecipitazione acquisisce solo RNA prodotta entro il breve tempo di etichettatura, lentamente prodotta così come rapidamente degradato RNA può essere difficile da misurare da questo metodo. Il RNA 5-Bromouridine-labelled catturato da 5-Bromouridine-immunoprecipitazione può essere analizzato da trascrizione d'inversione, reazione a catena della polimerasi quantitativa e sequenziamento di nuova generazione. Tutti i tipi di RNA possono essere indagati, e il metodo non è limitato alla misura mRNA come è presentato in questo esempio.

Introduzione

5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitazione (IP) permette lo studio della produzione di RNA nelle cellule con no o molto limitati effetti su cellule fisiologia durante il breve periodo^1,2di etichettatura. Il metodo si basa di incorporazione del derivato sintetico uridina BrU in RNA recentemente sintetizzato seguita da IP di RNA etichettato usando gli anticorpi anti-BrU (Figura 1).

È stato conosciuto per decenni quella sintesi della proteina possono essere regolata trascrizionalmente e l'esistenza di fattori di trascrizione è stata supposta più di 50 anni ....

Protocollo

Nota: Eseguire tutte le operazioni a temperatura ambiente, se non diversamente indicato e mantenere buffer su ghiaccio o in frigo (tranne dall'eluizione di tampone contenente SDS). Il protocollo è diviso in 5 sezioni: esempi di preparazione di RNA; preparazione di perline per IP; associazione del RNA BrU-etichettati per perline; eluizione e purificazione di RNA BrU-etichettati associato di estrazione del fenolo-fenolo/cloroformio-cloroformio 3 passi; analisi di RNA (in questo esempio usando RT-qPCR)

1. preparazione dei campioni di RNA

1. Conteggio HEK293T cellule utilizzando una cella automatizzata del contatore e seme 3.500.000 cell....

Risultati

I nostri test iniziale di tempo BrU-etichettatura sono state eseguite in cellule AsPC-1. Le cellule sono state trattate con BrU per 0, 1, 2 e 4,5 h, seguita da estrazione di RNA totale e BrU-IP. GAS5 e GAPDH sono stati misurati in BrU-IP RNA, che ha dimostrato che l'etichettatura 1h era sufficiente per raggiungere un circa 9 e 44 volte cambiamento rispetto allo sfondo (0h) per GAPDH e GAS5, rispettivamente.

BrU-IP e l'analisi so.......

Discussione

Questo protocollo descrive l'uso di BrU-IP per determinazione della produzione di RNA mediante etichettatura di recente prodotte RNA per 1 h con BrU, seguita da estrazione di RNA immediata e immunoprecipitazione di RNA BrU-etichettati. Questo metodo precedentemente è stato descritto nel riferimento¹⁶, e in questo articolo include alcuni passaggi aggiuntivi per aumentare la specificità IP e purezza RNA, dai branelli di pre-trattamento con basse concentrazioni di BrU, nonché una fase di purificazion.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Inibitore della Rnasi di Ribolock	ThermoFisher	EO0381
Dynabeads M-280 IgG di pecora anti-topo Life	Technologies	11202D
α-Bromodeoxyuridine anticorpo di topo	BD Bioscience	555627
Nanodrop 1000	Thermo Fisher		Spettrofotometria ultravioletto-visibile
Fenolo saturo d'acqua pH 6.6	ThermoFisher	AM9712
Fenolo:Cloroformio:IAA 25:24:1 pH 6.6	ThermoFisher	AM9732
Kit di isolamento dell'RNA ad alta purezza	Roche	11828665001
Kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacità	ThermoFisher	4368814
Taqman Fast Advanced Master Mix	ThermoFisher	4444557	qPCR Master Mix
Sonde RNA Taqman	ThermoFisher	SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1	Sonde flurogeniche
7500 Sistema di PCR veloce in tempo reale	Applied Biosystems
HEK293T linea cellulare	ATCC
Lonza media dell'aquila modificata di Dulbecco		BE12-604F
Siero fetale di vitello	Biochrom	S0115
Penicillina/Streptomicina	Biochrom	A2213
tampone			5,3 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,2 mM Na2HPO4 e 136,8 mM NaCl pH 6,77, sterilizzato in autoclave.
DEPC-H2O			0,1% dietilpirocarbonato trattato H2O
2xBrU-IP tampone			40 mM Tris-HCl pH 7,5 e 500 mM NaCl in DEPC H2O
2xBrU-IP+BSA/RNAsi inibitore			2xBrU-IP tampone integrato con 1 μ g/μ L BSA e 80 U/mL Ribolock
BrU-IP+, 1 mg/mL di eparina			2xBrU-IP, tampone diluito 1:1, DEPC-H2O e integrato con 1 mg/mL di eparina,
1xBrU-IP			2xBrU-IP, tampone diluito 1:1 in DEPC-H2O e integrato con 0,5 μ g/μ L BSA e 20 U/mL
di tampone			0,1% SDS in H2O privo di RNAsi

di Hank , , di eluizione Ribolock