Codice genetico espansione serve come un potente strumento per studiare una vasta gamma di processi biologici, compreso l'acetilazione della proteina. Qui dimostriamo che un protocollo facile sfruttare questa tecnica per la generazione in modo omogeneo acetilato proteine in siti specifici in cellule di Escherichia coli .
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Articolo metodologico
Un protocollo Facile generare proteine site-specifically acetilati in Escherichia Coli
In questo articolo
Sommario
Abstract
Modificazioni post-traduzionali che si verificano alle posizioni specifiche delle proteine hanno dimostrati di svolgere un ruolo importante in una varietà di processi cellulari. Fra loro, acetilazione reversibile lisina è uno dei più ampiamente distribuita in tutti i domini della vita. Sebbene siano stati condotti numerosi studi basati sulla spettrometria di massa acetylome, ulteriore caratterizzazione di questi bersagli putativi acetilazione è stato limitato. Una possibile ragione è che è difficile generare proteine puramente acetilati alle posizioni desiderate dalla maggior parte degli approcci biochimica classica. Per superare questa sfida, la tecnica di espansione del codice genetico è stata applicata per utilizzare la coppia di una variante di derivati dal pyrrolysyl-tRNA sintetasi e sue cognate tRNA da specie Methanosarcinaceae , per dirigere l'incorporazione di cotranslational di acetyllysine presso il sito specifico della proteina di interesse. Dopo la prima applicazione nello studio di acetilazione dell'istone, questo approccio ha facilitato gli studi di acetilazione su una varietà di proteine. In questo lavoro, abbiamo dimostrato un protocollo facile per produrre proteine site-specifically acetilati utilizzando il batterio Escherichia coli di modello come host. La malato deidrogenasi è stata utilizzata come un esempio di dimostrazione in questo lavoro.
Introduzione
Modificazioni post-traduzionali (PTM) delle proteine si verificano dopo il processo di traduzione e derivano da covalente aggiunta di gruppi funzionali ai residui dell'amminoacido, giocando ruoli importanti in quasi tutti i processi biologici, tra cui gene trascrizione, risposta allo stress, differenziazione cellulare e metabolismo1,2,3. Ad oggi, circa 400 distintivo PTMs sono state identificate4. La complessità del genoma e del proteoma è amplificata in grande misura dalla proteina PTMs, come essi regolano la localizzazione e l'attività della proteina....
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Protocollo
1. mutagenesi del Gene Target
Nota: MDH è espresso sotto promotore T7 nel vettore pCDF-1 con l'origine di CloDF13 e un numero di copia di 20 a 4034.
- Introdurre il codone di stop ambra nella posizione 140 nel gene di primer (forward primer: GGTGTTTATGACTAGAACAAACTGTTCGGCG e reverse primer: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), seguendo le istruzioni del kit di mutagenesi sito-diretta.
- Amplificare il plasmide di modello che contiene il gene della deidratasi di selvaggio-tipo malate e inserire la mutazione del codone di arresto dalla reazione della polimerasi reazione a ....
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Risultati
La resa di proteina acetilata di MDH era 15 mg al cultura L 1, mentre quello di selvaggio-tipo MDH era 31 mg / cultura 1 L. Le proteine purificate sono state analizzate da SDS-PAGE, come illustrato nella Figura 1. Il selvaggio-tipo MDH è stato usato come un controllo positivo34. La proteina purificata dalle cellule che harboring il sistema di incorporazione di acetyllysine (AcK) e il gene mutante mdh , ma senza AcK in mezzi di.......
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Discussione
La costituzione genetica degli aminoacidi noncanonical (ncAAs) si basa sulla soppressione di un codone assegnato, per lo più la fermata ambra codone UAG36,37,38,39, dal tRNA ncAA-pagano contenente l'anticodone corrispondente. Come è noto, il codone UAG viene riconosciuto dalla release factor-1 (RF1) nei batteri, e può anche essere soppressa da vicino cognate tRNAs da host praticati da aminoacid.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal NIH (AI119813), lo start-up presso la University of Arkansas e il premio dall'Arkansas Biosciences Institute.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dosaggio delle proteine Bradford | Bio-Rad | 5000006 | Concentrazione proteica |
| 4x Laemmli Tampone campione | Bio-Rad | 1610747 | Tampone campione SDS |
| Coomassie G-250 Colorazione | Bio-Rad | 1610786 | SDS-PAGE gel |
| 4-20% Gel pronto SDS-PAGE | Bio-Rad | 4561093 | Determinazione delle proteine |
| Ac-K-100 (HRP Conjugate) | Cell Segnalazione | 6952 | Anticorpo |
| IPTG | CHEM-IMPEX | 194 | Induttore di espressione |
| Nε -Aetil-L-lisina | CHEM-IMPEX | 5364 | dell'amminoacido non canonico |
| PD-10 | GE Healthcare | 17085101 | Kit di mutagenesi sito-specifica Q5 per la desalinizzazione |
| NEB | E0554 | Presentazione delle cellule del codone di stop | |
| BL21 (DE3) | NEB | C2527 | Espressione del ceppo |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | Estrazione di plasmidi |
| Resina Ni-NTA | QIAGEN | 30210 | Resina di purificazione per affinità |
| nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | Inibitore della deacetilasi |
| β-Mercaptoetanolo | Sigma-Aldrich | M6250 | Agente riducente |
| BugBuster Reagente per l'estrazione di proteine | Sigma-Aldrich | 70584 | Rottura di cellule |
| Benzonasi nucleasi | Sigma-Aldrich | E1014 | DNasi |
| ECL Western Blotting Substrato | ThermoFisher | 32106 | Chemiluminescenza |
| Brodo LB premiscelato | VWR | 97064 | Terreno di crescita cellulare |
| Albumina sierica bovina | VWR | 97061-416 | blocco delle macchie occidentali |
Riferimenti
- Krishna, R. G., Wold, F. Post-translational modification of proteins. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 67, 265-298 (1993).
- Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. Deciphering post-translational modification codes. FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).
- Walsh, C. T.....
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Ristampe e permessi
