Un protocollo Facile generare proteine site-specifically acetilati in Escherichia Coli
Summary
Codice genetico espansione serve come un potente strumento per studiare una vasta gamma di processi biologici, compreso l’acetilazione della proteina. Qui dimostriamo che un protocollo facile sfruttare questa tecnica per la generazione in modo omogeneo acetilato proteine in siti specifici in cellule di Escherichia coli .
Abstract
Modificazioni post-traduzionali che si verificano alle posizioni specifiche delle proteine hanno dimostrati di svolgere un ruolo importante in una varietà di processi cellulari. Fra loro, acetilazione reversibile lisina è uno dei più ampiamente distribuita in tutti i domini della vita. Sebbene siano stati condotti numerosi studi basati sulla spettrometria di massa acetylome, ulteriore caratterizzazione di questi bersagli putativi acetilazione è stato limitato. Una possibile ragione è che è difficile generare proteine puramente acetilati alle posizioni desiderate dalla maggior parte degli approcci biochimica classica. Per superare questa sfida, la tecnica di espansione del codice genetico è stata applicata per utilizzare la coppia di una variante di derivati dal pyrrolysyl-tRNA sintetasi e sue cognate tRNA da specie Methanosarcinaceae , per dirigere l’incorporazione di cotranslational di acetyllysine presso il sito specifico della proteina di interesse. Dopo la prima applicazione nello studio di acetilazione dell’istone, questo approccio ha facilitato gli studi di acetilazione su una varietà di proteine. In questo lavoro, abbiamo dimostrato un protocollo facile per produrre proteine site-specifically acetilati utilizzando il batterio Escherichia coli di modello come host. La malato deidrogenasi è stata utilizzata come un esempio di dimostrazione in questo lavoro.
Introduction
Modificazioni post-traduzionali (PTM) delle proteine si verificano dopo il processo di traduzione e derivano da covalente aggiunta di gruppi funzionali ai residui dell’amminoacido, giocando ruoli importanti in quasi tutti i processi biologici, tra cui gene trascrizione, risposta allo stress, differenziazione cellulare e metabolismo1,2,3. Ad oggi, circa 400 distintivo PTMs sono state identificate4. La complessità del genoma e del proteoma è amplificata in grande misura dalla proteina PTMs, come essi regolano la localizzazione e l’attività della proteina e influenzare l’interazione con altre molecole come proteine, acidi nucleici, lipidi e cofattori5.
Acetilazione della proteina è stato all’avanguardia di PTMs studi nell’ultimo ventennio6,7,8,9,10,11,12. Acetilazione di lisina in primo luogo è stato scoperto in istoni più di 50 anni fa13,14, ha stato bene esaminato ed è conosciuta per esistere in più di 80 fattori di trascrizione, regolatori e varie proteine15, 16,17. Studi sull’acetilazione della proteina hanno non solo ci ha fornito una comprensione più profonda dei suoi meccanismi di regolamentazione, ma anche trattamenti per un certo numero di malattie causate da disfunzionale acetilazione18,19, guidati 20 , 21 , 22 , 23. si credeva che l’acetilazione lisina accade solo negli eucarioti, ma recenti studi hanno dimostrato che acetilazione di proteina svolge anche ruoli chiave in fisiologia batterica, tra cui chemiotassi, resistenza agli acido, attivazione e stabilizzazione di Isole di patogenicità e altri virulenza relative proteine24,25,26,27,28,29.
Un metodo comunemente usato per caratterizzare biochimicamente acetilazione di lisina è mediante mutagenesi sito-diretta. Glutamina è usata come un mimo di acetyllysine a causa delle sue dimensioni simili e la polarità. Arginina è utilizzata come un mimo di lisina non-acetilati, poiché esso conserva la sua carica positiva in condizioni fisiologiche, ma non può essere acetilato. Tuttavia, entrambi imita non è veri isosteri e non sempre danno i risultati attesi30. L’approccio più rigoroso è quello di generare in modo omogeneo acetilati proteine ai residui di lisina specifico, che è difficile o impossibile per i più classici metodi a causa della bassa stechiometria di acetilazione di lisina in natura7,11. Questa sfida ha stata svelata dalla strategia di espansione di codice genetico, che impiega una derivati dal pyrrolysyl-tRNA-sintetasi variante da Methanosarcinaceae specie di addebitare tRNAPyl con acetyllysine, utilizza l’host traslazionale macchinari per sopprimere l’UAG codone nel mRNA di arresto e dirige l’incorporazione di acetyllysine in posizione progettata della proteina bersaglio31. Recentemente, abbiamo ottimizzato questo sistema con una migliore EF-Tu-associazione tRNA32 e un aggiornato acetyllysyl-tRNA sintetasi33. Inoltre, abbiamo applicato questo sistema avanzato incorporazione negli studi di acetilazione di malato deidrogenasi34 e tyrosyl-tRNA sintetasi35. Qui, dimostriamo il protocollo per la generazione di proteine puramente acetilati dalla clonazione molecolare per l’identificazione biochimica utilizzando la malato deidrogenasi (MDH), che abbiamo studiato estesamente come esempio dimostrativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La costituzione genetica degli aminoacidi noncanonical (ncAAs) si basa sulla soppressione di un codone assegnato, per lo più la fermata ambra codone UAG36,37,38,39, dal tRNA ncAA-pagano contenente l’anticodone corrispondente. Come è noto, il codone UAG viene riconosciuto dalla release factor-1 (RF1) nei batteri, e può anche essere soppressa da vicino cognate tRNAs da host praticati da aminoa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal NIH (AI119813), lo start-up presso la University of Arkansas e il premio dall’Arkansas Biosciences Institute.
Materials
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000006 | Protein concentration |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | SDS sample buffer |
| Coomassie G-250 Stain | Bio-Rad | 1610786 | SDS-PAGE gel staining |
| 4-20% SDS-PAGE ready gel | Bio-Rad | 4561093 | Protein determination |
| Ac-K-100 (HRP Conjugate) | Cell Signaling | 6952 | Antibody |
| IPTG | CHEM-IMPEX | 194 | Expression inducer |
| Nε-Acetyl-L-lysine | CHEM-IMPEX | 5364 | Noncanonical amino acid |
| PD-10 desalting column | GE Healthcare | 17085101 | Desalting |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | NEB | E0554 | Introducing the stop codon |
| BL21 (DE3) cells | NEB | C2527 | Expressing strain |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | Extracting plasmids |
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | Affinity purification resin |
| nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | Deacetylase inhibitor |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Reducing agent |
| BugBuster Protein Extraction Reagent | Sigma-Aldrich | 70584 | Breaking cells |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | DNase |
| ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | Chemiluminescence |
| Premixed LB Broth | VWR | 97064 | Cell growth medium |
| Bovine serum albumin | VWR | 97061-416 | western blots blocking |
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