Um protocolo Facile para gerar proteínas Site-Specifically acetiladas em Escherichia Coli
Summary
Expansão do código genético serve como uma ferramenta poderosa para estudar uma grande variedade de processos biológicos, incluindo acetilação de proteínas. Aqui vamos demonstrar um protocolo fácil de explorar esta técnica para gerar homogeneamente acetilado proteínas em locais específicos em células de Escherichia coli .
Abstract
Modificações borne-translational que ocorrem em posições específicas das proteínas foram mostradas para desempenhar um papel importante em uma variedade de processos celulares. Entre eles, a acetilação reversível lisina é um do mais amplamente distribuído em todos os domínios da vida. Apesar de numerosos estudos de espectrometria de massa-baseado acetylome foram realizados, ainda mais, caracterização dessas metas de acetilação putativo tem sido limitada. Uma razão possível é que é difícil gerar proteínas puramente acetiladas em posições desejadas pela maioria das abordagens bioquímicas clássicas. Para superar este desafio, a técnica de expansão do código genético foi aplicada para usar o par de uma variante do engenharia pyrrolysyl-tRNA sintetase e seu tRNA cognatos de espécies de Methanosarcinaceae , para dirigir a incorporação de cotranslational de acetyllysine no site específico da proteína de interesse. Após a primeira aplicação no estudo de acetilação da histona, esta abordagem tem facilitado a estudos de acetilação em uma variedade de proteínas. Neste trabalho, temos demonstrado um protocolo facile para produzir proteínas site-specifically acetificadas usando a bactéria modelo Escherichia coli como o anfitrião. Malato desidrogenase foi usado como um exemplo de demonstração neste trabalho.
Introduction
Modificações borne-translational (PTMs) de proteínas ocorrerem após o processo de tradução e surgem de adição covalente de grupos funcionais para resíduos de aminoácidos, desempenhando papéis importantes em quase todos os processos biológicos, incluindo o gene transcrição, resposta ao estresse, diferenciação celular e metabolismo1,2,3. Até à data, cerca de 400 distintivo PTMs foram identificados4. A complexidade do genoma e a proteoma é amplificada em grande medida por PTMs de proteína, como regular a localização e atividade da proteína e afetam a interação com outras moléculas tais como proteínas, ácidos nucleicos, lipídios e cofactores5.
Acetilação de proteínas tem estado na vanguarda dos estudos PTMs nas últimas duas décadas6,7,8,9,10,11,12. Acetilação de lisina foi descoberta em histonas há mais de 50 anos13,14, tem sido bem analisadas e é conhecida por existir em mais de 80 fatores de transcrição, reguladores e várias proteínas15, 16,17. Estudos na acetilação de proteínas não apenas nos proporcionou uma compreensão mais profunda de seus mecanismos reguladores, mas também guiada tratamentos para uma série de doenças causadas por acetilação disfuncional18,19, 20 , 21 , 22 , 23. acreditava-se que a acetilação de lisina só acontece nos eucariontes, mas estudos recentes têm mostrado que acetilação de proteínas também desempenha papéis-chave na fisiologia bacteriana, incluindo a quimiotaxia, resistência ácida, ativação e estabilização do Ilhas de patogenicidade e virulência outra relacionadas com proteínas24,25,26,,27,28,29.
Um método comumente usado para caracterizar bioquimicamente acetilação de lisina é usando o mutagenesis local-dirigido. Glutamina é usada como um mímico de acetyllysine por causa de seu tamanho semelhante e polaridade. Arginina é utilizada como uma mímica de lisina não-acetilado, uma vez que preserva a sua carga positiva sob condições fisiológicas, mas não pode ser acetilado. No entanto, ambos imita não é isosteres real e não sempre produzir os resultados esperados30. A abordagem mais rigorosa é gerar proteínas homogeneamente acetiladas em resíduos de lisina específica, que é difícil ou impossível para métodos mais clássicos, devido a baixa estequiometria da acetilação de lisina na natureza7,11. Este desafio tem sido desvendado pela estratégia de expansão de código genético, que emprega uma engenharia pyrrolysyl-tRNA sintetasePyl com acetyllysine, variante de Methanosarcinaceae espécie de cobrar tRNA que utiliza o host translacional máquinas para suprimir o UAG parar códon no mRNA e direciona a incorporação de acetyllysine na posição projetada da proteína alvo31. Recentemente, otimizamos o sistema com uma melhoria de tRNA EF-Tu-ligação32 e um atualizado acetyllysyl-tRNA sintetase33. Além disso, temos aplicado este sistema de incorporação reforçada em estudos de acetilação da malato desidrogenase34 e correntes-tRNA sintetase35. Aqui, demonstramos o protocolo para gerar proteínas puramente acetiladas da clonagem molecular para identificação bioquímica usando malato desidrogenase (MDH), que temos estudado extensivamente como um exemplo demonstrativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
A incorporação genética de aminoácidos não-canônico (ncAAs) baseia-se a supressão de um codão atribuído, principalmente o âmbar stop códon UAG36,37,38,39, pelo tRNA ncAA-carregada contendo o anticodão correspondente. Como é sabido, o códon UAG é reconhecido pelo lançamento factor-1 (RF1) em bactérias, e isso pode também ser suprimido por perto os tRNAs cognata de hosts cobrado…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH (AI119813), o arranque da Universidade de Arkansas e o prêmio do Instituto de Biociências de Arkansas.
Materials
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000006 | Protein concentration |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | SDS sample buffer |
| Coomassie G-250 Stain | Bio-Rad | 1610786 | SDS-PAGE gel staining |
| 4-20% SDS-PAGE ready gel | Bio-Rad | 4561093 | Protein determination |
| Ac-K-100 (HRP Conjugate) | Cell Signaling | 6952 | Antibody |
| IPTG | CHEM-IMPEX | 194 | Expression inducer |
| Nε-Acetyl-L-lysine | CHEM-IMPEX | 5364 | Noncanonical amino acid |
| PD-10 desalting column | GE Healthcare | 17085101 | Desalting |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | NEB | E0554 | Introducing the stop codon |
| BL21 (DE3) cells | NEB | C2527 | Expressing strain |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | Extracting plasmids |
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | Affinity purification resin |
| nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | Deacetylase inhibitor |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Reducing agent |
| BugBuster Protein Extraction Reagent | Sigma-Aldrich | 70584 | Breaking cells |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | DNase |
| ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | Chemiluminescence |
| Premixed LB Broth | VWR | 97064 | Cell growth medium |
| Bovine serum albumin | VWR | 97061-416 | western blots blocking |
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