Ett lättköpt protokoll att generera anläggningsvis acetylerade proteiner i Escherichia Coli
Summary
Genetiska koden expansion fungerar som ett kraftfullt verktyg för att studera en mängd biologiska processer, inklusive protein acetylering. Här visar vi ett lättköpt protokoll att utnyttja denna teknik för att generera homogeneously acetylerade proteiner på specifika platser i Escherichia coli celler.
Abstract
Post-translationella modifieringar som förekommer vid specifika positioner av proteiner har visat sig spela en viktig roll i en mängd olika cellulära processer. Bland dem är reversibel lysin acetylering en av de mest spridda i alla domäner i livet. Även om många mass spectrometry-baserade acetylome studier har utförts, har ytterligare karakterisering av dessa förmodade acetylering mål varit begränsad. En möjlig orsak är att det är svårt att generera rent acetylerade proteiner på önskade positioner genom de flesta klassiska biokemiska metoder. För att övervinna denna utmaning, har den genetiska kod expansion tekniken tillämpats för att använda par en konstruerad pyrrolysyl-tRNA Synthetasen variant, och dess cognate tRNA från Methanosarcinaceae arter, direkt cotranslational införlivande av acetyllysine på den specifika platsen i proteinet av intresse. Efter första ansökan i studien av Histon acetylering, har detta tillvägagångssätt underlättat acetylering studier på en mängd olika proteiner. I detta arbete visat vi ett lättköpt protokoll för att producera anläggningsvis acetylerade proteiner med hjälp av modell bakterien Escherichia coli som värd. Malate dehydrogenas användes som en demonstration exempel i detta arbete.
Introduction
Post-translationella modifieringar (PTMs) av proteiner uppstår efter översättningsprocessen och uppstår från kovalent tillägg av funktionella grupper till aminosyra rester, spelar viktiga roller i nästan alla biologiska processer, inklusive gen transkription, stressreaktion, celldifferentiering och metabolism1,2,3. Hittills har cirka 400 distinkta varit PTMs identifierade4. Krångliga genomet och proteomet förstärks i stor utsträckning av protein PTMs, som de reglerar protein aktivitet och lokalisering, och påverkar samspelet med andra molekyler som kofaktorer5, lipider, proteiner och nukleinsyror.
Protein acetylering har varit i spetsen för PTMs studier i senaste två decennierna6,7,8,9,10,11,12. Lysin acetylering upptäcktes först i Histonerna mer än 50 år sedan13,14, har varit väl granskas, och finns i mer än 80 transkriptionsfaktorer, tillsynsmyndigheter och olika proteiner15, 16,17. Studier på protein acetylering har inte bara gett oss en djupare förståelse för dess reglerande mekanismer, men även guidade behandlingar för ett antal sjukdomar som orsakas av dysfunktionella acetylering18,19, 20 , 21 , 22 , 23. trodde att lysin acetylering bara händer i Eukaryoter, men nyare studier har visat att protein acetylering också spelar viktiga roller i bakteriell fysiologi, inklusive Kemotaxis, acid motstånd, aktivering och stabilisering av patogenicitet öar och andra virulens relaterade proteiner24,25,26,27,28,29.
En vanligt förekommande metod att biokemiskt karakterisera lysin acetylering använder webbplats riktad mutagenes. Glutamin används som en härma av acetyllysine på grund av dess liknande storlek och polaritet. Arginin är utnyttjas som en icke-acetylerade lysin härma, eftersom det bevarar dess positiva laddning under fysiologiska betingelser men kan inte vara acetylerade. Men båda härmar är inte riktiga isosteres och ger inte alltid de förväntade resultat30. Den mest rigorösa strategin är att generera homogeneously acetylerade proteiner vid specifika lysin rester, som är svårt eller omöjligt för mest klassiska metoder på grund av den låga stökiometri av lysin acetylering i naturen7,11. Denna utmaning har varit avslöjad av den genetiska kod expansionsstrategin, som sysselsätter en konstruerad pyrrolysyl-tRNA-syntetas variant från Methanosarcinaceae arter att ladda tRNAenPyl med acetyllysine, använder tredjeparts värden translationell maskiner att undertrycka UAG stoppa codon i mRNA och dirigerar införlivandet av acetyllysine i mål protein31designade ställning. Nyligen har vi optimerat detta system med en förbättrad EF-Tu-bindning tRNA32 och en uppgraderad acetyllysyl-tRNA Synthetasen33. Vi har dessutom tillämpat Detta förbättrade inkorporering system i acetylering studier malate dehydrogenas34 och tyrosyl-tRNA Synthetasen35. Häri, visar vi protokollet för att generera rent acetylerade proteiner från molekylär kloning att biokemiska identifiering med hjälp av malate dehydrogenas (MDH), som vi har i stor utsträckning studerat som en demonstrativ exempel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genetiska införlivandet av noncanonical aminosyror (ncAAs) är baserad på undertryckandet av en tilldelade kodon, mestadels bärnsten stop kodon UAG36,37,38,39, av de ncAA-laddad tRNAen som innehåller den motsvarande Anticodonen. Som är känd, den UAG Codonen är erkänd av den frige factor-1 (RF1) i bakterier och det kan också dämpas av nära besläktat tRNAs från värdar debiteras av k…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NIH (AI119813), start från University of Arkansas, och award från Arkansas Biosciences Institute.
Materials
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000006 | Protein concentration |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | SDS sample buffer |
| Coomassie G-250 Stain | Bio-Rad | 1610786 | SDS-PAGE gel staining |
| 4-20% SDS-PAGE ready gel | Bio-Rad | 4561093 | Protein determination |
| Ac-K-100 (HRP Conjugate) | Cell Signaling | 6952 | Antibody |
| IPTG | CHEM-IMPEX | 194 | Expression inducer |
| Nε-Acetyl-L-lysine | CHEM-IMPEX | 5364 | Noncanonical amino acid |
| PD-10 desalting column | GE Healthcare | 17085101 | Desalting |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | NEB | E0554 | Introducing the stop codon |
| BL21 (DE3) cells | NEB | C2527 | Expressing strain |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | Extracting plasmids |
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | Affinity purification resin |
| nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | Deacetylase inhibitor |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Reducing agent |
| BugBuster Protein Extraction Reagent | Sigma-Aldrich | 70584 | Breaking cells |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | DNase |
| ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | Chemiluminescence |
| Premixed LB Broth | VWR | 97064 | Cell growth medium |
| Bovine serum albumin | VWR | 97061-416 | western blots blocking |
Riferimenti
- Krishna, R. G., Wold, F. Post-translational modification of proteins. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 67, 265-298 (1993).
- Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. Deciphering post-translational modification codes. FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).
- Walsh, C. T. . Posttranslational modification of proteins : expanding nature’s inventory. , (2006).
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Sci Rep. 1, (2011).
- Grotenbreg, G., Ploegh, H. Chemical biology: dressed-up proteins. Nature. 446 (7139), 993-995 (2007).
- Arif, M., Selvi, B. R., Kundu, T. K. Lysine acetylation: the tale of a modification from transcription regulation to metabolism. Chembiochem. 11 (11), 1501-1504 (2010).
- Cohen, T., Yao, T. P. AcK-knowledge reversible acetylation. Science’s STKE : signal transduction knowledge environment. (245), pe42 (2004).
- Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
- Escalante-Semerena, J. C. Nε-acetylation control conserved in all three life domains. Microbe. 5, 340-344 (2010).
- Kouzarides, T. Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation?. The EMBO journal. 19 (6), 1176-1179 (2000).
- Soppa, J. Protein acetylation in archaea, bacteria, and eukaryotes. Archaea. , (2010).
- Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
- Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. P Natl Acad Sci USA. 51, 786-794 (1964).
- Phillips, D. M. The presence of acetyl groups of histones. Biochem j. 87, 258-263 (1963).
- Sterner, D. E., Berger, S. L. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiology and molecular biology reviews: MMBR. 64 (2), 435-459 (2000).
- Glozak, M. A., Sengupta, N., Zhang, X., Seto, E. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene. 363, 15-23 (2005).
- Close, P., et al. The emerging role of lysine acetylation of non-nuclear proteins. Cell Mol Life Sci. 67 (8), 1255-1264 (2010).
- Iyer, A., Fairlie, D. P., Brown, L. Lysine acetylation in obesity, diabetes and metabolic disease. Immunol Cell Biol. 90 (1), 39-46 (2012).
- You, L., Nie, J., Sun, W. J., Zheng, Z. Q., Yang, X. J. Lysine acetylation: enzymes, bromodomains and links to different diseases. Essays Biochem. 52, 1-12 (2012).
- Bonnaud, E. M., Suberbielle, E., Malnou, C. E. Histone acetylation in neuronal (dys)function. Biomol Concepts. 7 (2), 103-116 (2016).
- Fukushima, A., Lopaschuk, G. D. Acetylation control of cardiac fatty acid beta-oxidation and energy metabolism in obesity, diabetes, and heart failure. Biochim Biophys Acta. 1862 (12), 2211-2220 (2016).
- Kaypee, S., et al. Aberrant lysine acetylation in tumorigenesis: Implications in the development of therapeutics. Pharmacol Ther. 162, 98-119 (2016).
- Tapias, A., Wang, Z. Q. Lysine Acetylation and Deacetylation in Brain Development and Neuropathies. Genomics Proteomics Bioinformatics. 15 (1), 19-36 (2017).
- Hu, L. I., Lima, B. P., Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: the dawning of a new age. Molecular microbiology. 77 (1), 15-21 (2010).
- Jones, J. D., O’Connor, C. D. Protein acetylation in prokaryotes. Proteomics. 11 (15), 3012-3022 (2011).
- Bernal, V., et al. Regulation of bacterial physiology by lysine acetylation of proteins. New biotechnol. 31 (6), 586-595 (2014).
- Hentchel, K. L., Escalante-Semerena, J. C. Acylation of Biomolecules in Prokaryotes: a Widespread Strategy for the Control of Biological Function and Metabolic Stress. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 79 (3), 321-346 (2015).
- Ouidir, T., Kentache, T., Hardouin, J. Protein lysine acetylation in bacteria: Current state of the art. Proteomics. 16 (2), 301-309 (2016).
- Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: new discoveries unanswered questions. Curr Genet. 62 (2), 335-341 (2016).
- Albaugh, B. N., Arnold, K. M., Lee, S., Denu, J. M. Autoacetylation of the histone acetyltransferase Rtt109. J Biol Chem. 286 (28), 24694-24701 (2011).
- Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding Nε-acetyllysine in recombinant proteins. Nat chem biol. 4 (4), 232-234 (2008).
- Fan, C., Xiong, H., Reynolds, N. M., Soll, D. Rationally evolving tRNAPyl for efficient incorporation of noncanonical amino acids. Nucleic Acids Res. 43 (22), e156 (2015).
- Bryson, D., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases to alter amino acid specificity and enhance activity. Nat Chem Biol. , (2017).
- Venkat, S., Gregory, C., Sturges, J., Gan, Q., Fan, C. Studying the Lysine Acetylation of Malate Dehydrogenase. J Mol Biol. 429 (9), 1396-1405 (2017).
- Venkat, S., Gregory, C., Gan, Q., Fan, C. Biochemical characterization of the lysine acetylation of tyrosyl-tRNA synthetase in Escherichia coli. Chembiochem. 18 (19), 1928-1934 (2017).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
- Mukai, T., Lajoie, M. J., Englert, M., Soll, D. Rewriting the Genetic Code. Annu Rev Microbiol. , (2017).
- O’Donoghue, P., Ling, J., Wang, Y. S., Soll, D. Upgrading protein synthesis for synthetic biology. Nat Chem Biol. 9 (10), 594-598 (2013).
- Chin, J. W. Expanding and reprogramming the genetic code of cells and animals. Annu Rev Biochem. 83, 379-408 (2014).
- O’Donoghue, P., et al. Near-cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl-tRNAPyl for genetic code expansion. FEBS Lett. 586 (21), 3931-3937 (2012).
- Aerni, H. R., Shifman, M. A., Rogulina, S., O’Donoghue, P., Rinehart, J. Revealing the amino acid composition of proteins within an expanded genetic code. Nucleic Acids Res. 43 (2), e8 (2015).
- Huang, Y., et al. A convenient method for genetic incorporation of multiple noncanonical amino acids into one protein in Escherichia coli. Mol Biosyst. 6 (4), 683-686 (2010).
- Venkat, S., et al. Genetically encoding thioacetyl-lysine as a nondeacetylatable analog of lysine acetylation in Escherichia coli. FEBS Open. , (2017).
- Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
- Gregoretti, I. V., Lee, Y. M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. J Mol Biol. 338 (1), 17-31 (2004).
- Weinert, B. T., et al. Acetyl-phosphate is a critical determinant of lysine acetylation in E. coli. Mol cell. 51 (2), 265-272 (2013).
