Beoordeling van extracellulaire vesikel functie tijdens Malaria infectie
Summary
In dit werk beschrijven we protocollen voor het onderzoek naar de rol van extracellulaire blaasjes (EVs) uitgebracht door Plasmodium falciparum geïnfecteerd erytrocyten. In het bijzonder richten we ons op de interacties van EVW met endotheliale cellen.
Abstract
Malaria is een levensbedreigende ziekte veroorzaakt door Plasmodium parasieten, met P. falciparum is de meest voorkomende op het Afrikaanse continent en die verantwoordelijk is voor de meeste malaria sterfgevallen wereldwijd. Verschillende factoren, met inbegrip van vastlegging van de parasiet in de weefsels, vasculaire dysfunctie en inflammatoire reacties beïnvloedt de ontwikkeling van de ziekte malaria-geïnfecteerd mensen. P. falciparum-geïnfecteerde rode bloedcellen (iRBCs) vrij kleine extracellulaire blaasjes (EVs) met verschillende soorten lading moleculen die pathogenese en mobiele communicatie tussen parasieten en host bemiddelen. EVW zijn efficiënt opgepakt door cellen waarin zij hun functie moduleren. Hier bespreken we strategieën om de rol van het EVW in de parasiet-gastheer interacties. Eerst beschrijven we een eenvoudige methode voor het benoemen en tracking EV internalisering door endotheliale cellen, met behulp van een groene cel linker kleurstof. Ten tweede, rapporteren we een eenvoudige manier om te meten permeabiliteit over een enkelgelaagde endothelial cel met behulp van een fluorescently geëtiketteerde dextran. Tot slot laten we zien hoe te onderzoeken van de rol van kleine niet-coderende RNA-moleculen in functie endothelial cel.
Introduction
Volgens de World Health Organization, er waren 212 miljoen nieuwe gevallen van malaria wereldwijd in 2015 en ongeveer 429,000 mensen zijn omgekomen, voornamelijk kinderen jonger dan vijf jaar leeftijd1. De mechanismen die leiden tot een ernstige aandoening, die vaak geassocieerd met vasculaire dysfunctie wordt, blijven vaag2. Plasmodium– iRBCs afscheiden kleine bi-lipide membraan bollen extracellulaire blaasjes (EVs) genoemd. Het is bekend dat deze EVs potentieel relevant zijn aan het proces van de infectie en aan de immuunrespons van de gastheer voor infectie; echter, er is weinig bekend over de exacte functie van deze kleine blaasjes tijdens malaria infectie3. Het is mogelijk dat zij twee belangrijke rollen spelen: aan de ene kant kunnen ze bijdragen aan de pathogenese door activering van macrofagen4,5; en aan de andere kant, ze cellulaire communicatie tussen parasieten en tussen parasieten en host6,7zou kunnen bemiddelen. In feite, kunnen parasieten overbrengen eiwitten of nucleïnezuren tussen elkaar via EVs. Bijvoorbeeld, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs virulentiefactor Serum Resistance-Associated (SRA) kunt overbrengen, en zowel andere T. brucei en gastheer erytrocyten8kunt richten. Bovendien, P. falciparum– iRBCs communicatie tussen elkaar door de overdracht van nucleïnezuren binnen EVs. Hierdoor is de parasieten te optimaliseren en haar groei te synchroniseren. EVs kunnen in feite worden de belangrijke regulator van gametocyt conversie en dragen dus bij tot de regulering van de transmissie fase7.
Niet alleen doen EVs regelen de parasieten, ze ook bemiddelen parasiet-gastheer interacties. Onlangs ontdekten we dat EVs van iRBCs host-afgeleide microRNAs (miRNAs; kleine soorten van de RNA in het bereik van 21-25 nucleotiden9) die in beslag door menselijke endotheliale cellen genomen waren bevatten. De miRNAs in de EVs vormen een stabiele complex met Ago2 (een lid van de RNA-geïnduceerde silencing complex), die zodra geleverd aan de ontvangende cellen, in staat is van specifiek monddood maken van de expressie van genen en invloed op de eigenschappen van de barrière van de cellen10. Standaard protocollen zijn ontwikkeld voor het onderzoek naar de functie van het EVW. Hier beschrijven we eerst een protocol waarmee de fluorescerende labeling van het EVW te onderzoeken hun acceptatie door de ontvangende cellen. Bovendien, met behulp van een confocal microscoop, is het mogelijk om bij te houden van de EV lot in de cel. Verschillende fluorescente kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor het bijhouden van EVs. De amine-reactieve kleurstof, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein-DIACETAAT-Succinimidyl Ester (CFSE) en calceïne-AM geworden TL eenmaal binnen de blaasjes. Wij graag gebruiken het amfifiele label, PKH, want het geeft een helderder en meer uniforme signaal. Deze aanpak geeft belangrijke informatie om te begrijpen van de interacties tussen het EVW en ontvangende cellen. Terwijl in sommige gevallen EVs aan het oppervlak van de cellen binden, worden sommige blaasjes snel opgenomen. Bij opname leveren EVs hun lading aan de cellen, waarin zij hun regelgevende taken uitoefenen.
Hier beschrijven we een protocol voor het meten van de barrièrefunctie van de endotheliale cellen in vitro door het kwantificeren van de overdracht van een fluorescerende dextran via een cellulaire enkelgelaagde. Gevoeliger traceurs kunnen worden gebruikt zoals radiolabeled markeringen. Ze vereisen echter speciale voorzorgsmaatregelen voor gebruik. Andere testen bestaan voor het meten van de barrièrefunctie in vitro zoals signaalcomplexen elektrische weerstand (TEER), die tight junction integriteit meet. Tot slot het visualiseren van ZO-1, een strakke junction eiwit, met immunofluorescentie kunt beoordeling van strakke junction betrouwbaarheid als goed10. Aangezien EVs complexe en heterogene entiteiten met verschillende ladingen met potentiële regelgevende karakteristiek zijn, is het nuttig om te overexpress een specifieke RNA om te bestuderen van de gevolgen daarvan voor de ontvangende cel. Daarom, definiëren we ook een protocol dat gericht is op het genereren van stabiele cellijnen uiten de miRNA van belang10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verscheidene parasieten, waaronder Toxoplasma, Leishmania, Trypanosoma en Trichomonas leiden tot de release van het EVW door de geïnfecteerde gastheercel. Afhankelijk van de ziekteverwekkers, kunnen de vrijgegeven EVs moduleren van de immuunrespons van de gastheer of cellulaire communicatie tussen de parasieten6bemiddelen. Toch is er weinig aanwijzingen hoe deze kleine blaasjes bijdragen aan de ziekte malaria. Hier hebben we verschillende manieren om te onderzoeken van de functie van het EVW tijd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd financieel gedeeltelijk ondersteund door de Stichting Novartis voor medisch – biologisch onderzoek (naar PYM), de Gottfried en Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (aan MW en PYM) en het zwembad van het onderzoek van de Universiteit van Freiburg (naar PYM). Aanvullende rechten omvatten de Zwitserse regering Excellence beurzen voor buitenlandse geleerden (KAB en SM). Wij danken Isabelle Fellay en Solange Kharoubi Hess voor technische ondersteuning.
Materials
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher – Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit | Biovision | K300-500 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions | ThermoFisher | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, with UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
Riferimenti
- WHO. . WHO Malaria Report 2015. , (2015).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).
- Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).
- Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727 (2016).
- Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
- Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).
- Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).
- Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
