In questo lavoro descriviamo protocolli per studiare il ruolo delle vescicole extracellulari (SVE) rilasciato dagli eritrociti Plasmodium falciparum infettati. In particolare, ci concentriamo sulle interazioni con le cellule endoteliali del SVE.
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Articolo metodologico
Valutazione della funzione delle vescicole extracellulari durante l'infezione malarica
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La malaria è una malattia pericolosa causata da parassiti del plasmodio , con p. falciparum è la più diffusa nel continente africano e responsabile della maggior parte dei decessi per malaria a livello globale. Diversi fattori tra cui il sequestro del parassita nei tessuti, disfunzione vascolare e le risposte infiammatorie influenzano l'evoluzione della malattia nelle persone con infezione da malaria. P. falciparum-globuli rossi infetti (iRBCs) rilasciare piccole vescicole extracellulari (SVE) contenente diversi tipi di molecole di carico che mediano la comunicazione cellulare e patogenesi tra parassiti e host. SVE in modo efficiente sono presi dalle cellule in cui si modula la loro funzione. Qui si discute di strategie per affrontare il ruolo del server virtuale di Exchange nelle interazioni parassita-ospite. In primo luogo, descriviamo un metodo semplice per l'etichettatura ed EV interiorizzazione di rilevamento dalle cellule endoteliali, utilizzando un colorante del linker cella verde. In secondo luogo, segnaliamo un modo semplice per misurare la permeabilità attraverso un monostrato di cellule endoteliali utilizzando un destrano fluorescente contrassegnato. Infine, vi mostriamo come studiare il ruolo di piccole molecole di RNA non codificanti nella funzione delle cellule endoteliali.
Introduzione
Secondo l'organizzazione mondiale della sanità, c'erano 212 milioni di nuovi casi di malaria nel mondo nel 2015 e morirono circa 429.000 persone, principalmente bambini sotto i cinque anni di età1. I meccanismi che conducono alla malattia severa, che spesso è associata con disfunzione vascolare, rimangono mal definiti2. Plasmodium- iRBCs secernono sfere piccole bi-lipido membrana conosciute come vescicole extracellulari (EVs). È noto che queste SVE sono potenzialmente rilevanti per il processo di infezione e la risposta immunitaria all'infezione; Tuttavia, piccolo è conosciuto circa la funzione esatta di queste ....
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Protocollo
Globuli rossi umani sono stati ottenuti dal sangue di donatori sani, conformemente agli orientamenti di Swissethics (swissethics.ch).
Nota: P. falciparum parassita culture (3 7) ed EV produzione precedentemente sono stati descritti in Mbagwu, et al. 11 perché p. falciparum è un patogeno umano, consultare i regolamenti locali per la manipolazione. Le culture dovrebbero essere tenute sterile l'intero tempo.
1. fluorescenza etichettatura del SVE
Nota: La procedura seguente si avvale della tecnologia d'etichettatura per incorporare stabilmen....
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Risultati
Qui, descriviamo protocolli per studiare le interazioni del SVE con cellule dell'ospite. L'assorbimento di fluorescente contrassegnati EVs è monitorata mediante microscopia confocale (Figura 1). Cellule endoteliali prendono efficientemente EVs, comunque il tempo di incubazione con SVE può essere ottimizzato per monitorare l'assorbimento. Per una migliore localizzazione del SVE all'interno delle cellule, macchia di actina con falloidina. Quindi, utilizziamo un.......
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Discussione
Diversi parassiti, tra cui il Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania e Trichomonas innescano il rilascio di EVs dalla cellula ospite infetto. A seconda dei patogeni, lo SVE rilasciato possono modulare la risposta immunitaria o mediare la comunicazione cellulare tra i parassiti6. Ancora, ci è poca prova che suggerisce come queste piccole vescicole contribuiscono alla malattia di malaria. Qui, abbiamo descritto diversi modi per studiare la funzione del server virtuale di Exchange durante l'infezione da.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto finanziariamente in parte dalla Fondazione Novartis per medical - ricerca biologica (a PYM), il Gottfried e Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (a MW e PYM) e la piscina di ricerca dell'Università di Friburgo (a PYM). Ulteriori contributi comprendono le borse di eccellenza della Confederazione Svizzera per studiosi stranieri (di KAB e SM). Ringraziamo Isabelle Fellay e Solange Kharoubi Hess per supporto tecnico.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| PKH67 Verde Fluorescente Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluente C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher - Gibco | 10010023 | |
| falloidina CF594 | Biozio | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Isotiocianato di rodamina B... Destrano | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Inserto con membrana in PET Falco trasparente per piastra 24 pozzetti Falcon | 353095 | ||
| Crescita delle cellule endoteliali Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromicina dicloridrato | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Kit di dosaggio colorimetrico per la proliferazione cellulare | Biovision | K300-500 | |
| esadimetrina bromuro | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSIONE Lenti microRNA, umano has-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, controllo negativo 1 particelle di trasduzione | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Umano | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Kit di Trascrizione Inversa 1000 reazioni | ThermoFisher | 4366597 | |
| has-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, con UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Sistema di PCR in tempo reale | ThermoFisher | 4376600 |
Riferimenti
- WHO. WHO Malaria Report 2015. , (2015).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan p....
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Ristampe e permessi
