Valutazione della funzione delle vescicole extracellulari durante l'infezione malarica

Summary

In questo lavoro descriviamo protocolli per studiare il ruolo delle vescicole extracellulari (SVE) rilasciato dagli eritrociti Plasmodium falciparum infettati. In particolare, ci concentriamo sulle interazioni con le cellule endoteliali del SVE.

Abstract

La malaria è una malattia pericolosa causata da parassiti del plasmodio , con p. falciparum è la più diffusa nel continente africano e responsabile della maggior parte dei decessi per malaria a livello globale. Diversi fattori tra cui il sequestro del parassita nei tessuti, disfunzione vascolare e le risposte infiammatorie influenzano l'evoluzione della malattia nelle persone con infezione da malaria. P. falciparum-globuli rossi infetti (iRBCs) rilasciare piccole vescicole extracellulari (SVE) contenente diversi tipi di molecole di carico che mediano la comunicazione cellulare e patogenesi tra parassiti e host. SVE in modo efficiente sono presi dalle cellule in cui si modula la loro funzione. Qui si discute di strategie per affrontare il ruolo del server virtuale di Exchange nelle interazioni parassita-ospite. In primo luogo, descriviamo un metodo semplice per l'etichettatura ed EV interiorizzazione di rilevamento dalle cellule endoteliali, utilizzando un colorante del linker cella verde. In secondo luogo, segnaliamo un modo semplice per misurare la permeabilità attraverso un monostrato di cellule endoteliali utilizzando un destrano fluorescente contrassegnato. Infine, vi mostriamo come studiare il ruolo di piccole molecole di RNA non codificanti nella funzione delle cellule endoteliali.

Introduction

Secondo l'organizzazione mondiale della sanità, c'erano 212 milioni di nuovi casi di malaria nel mondo nel 2015 e morirono circa 429.000 persone, principalmente bambini sotto i cinque anni di età¹. I meccanismi che conducono alla malattia severa, che spesso è associata con disfunzione vascolare, rimangono mal definiti². Plasmodium- iRBCs secernono sfere piccole bi-lipido membrana conosciute come vescicole extracellulari (EVs). È noto che queste SVE sono potenzialmente rilevanti per il processo di infezione e la risposta immunitaria all'infezione; Tuttavia, piccolo è conosciuto circa la funzione esatta di queste ....

Protocol

Globuli rossi umani sono stati ottenuti dal sangue di donatori sani, conformemente agli orientamenti di Swissethics (swissethics.ch).

Nota: P. falciparum parassita culture (3 7) ed EV produzione precedentemente sono stati descritti in Mbagwu, et al. ¹¹ perché p. falciparum è un patogeno umano, consultare i regolamenti locali per la manipolazione. Le culture dovrebbero essere tenute sterile l'intero tempo.

1. fluorescenza etichettatura del SVE

Nota: La procedura seguente si avvale della tecnologia d'etichettatura per incorporare stabilmen....

Results

Qui, descriviamo protocolli per studiare le interazioni del SVE con cellule dell'ospite. L'assorbimento di fluorescente contrassegnati EVs è monitorata mediante microscopia confocale (Figura 1). Cellule endoteliali prendono efficientemente EVs, comunque il tempo di incubazione con SVE può essere ottimizzato per monitorare l'assorbimento. Per una migliore localizzazione del SVE all'interno delle cellule, macchia di actina con falloidina. Quindi, utilizziamo un.......

Discussion

Diversi parassiti, tra cui il Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania e Trichomonas innescano il rilascio di EVs dalla cellula ospite infetto. A seconda dei patogeni, lo SVE rilasciato possono modulare la risposta immunitaria o mediare la comunicazione cellulare tra i parassiti⁶. Ancora, ci è poca prova che suggerisce come queste piccole vescicole contribuiscono alla malattia di malaria. Qui, abbiamo descritto diversi modi per studiare la funzione del server virtuale di Exchange durante l'infezione da.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PKH67 Verde Fluorescente Cell Linker Mini Kit	Sigma-Aldrich	MINI67-1KT
Diluente C	Sigma-Aldrich	G8278
poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P8920
PBS	ThermoFisher - Gibco	10010023
falloidina CF594	Biozio	#00045
Hoechst 33342	ThermoFisher	H3570
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36934
Isotiocianato di rodamina B... Destrano	ThermoFisher	R9379-250MG
Inserto con membrana in PET Falco trasparente per piastra 24 pozzetti Falcon		353095
Crescita delle cellule endoteliali  Medium MV	Promocell	C-22020
Puromicina dicloridrato	Sigma-Aldrich	P9620-10ML
MTS Kit di dosaggio colorimetrico per la proliferazione cellulare	Biovision	K300-500
esadimetrina bromuro	Sigma-Aldrich	107689-10G
MISSIONE  Lenti microRNA, umano has-miR-451a	Sigma-Aldrich	HLMIR0583
MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, controllo negativo 1 particelle di trasduzione	Sigma-Aldrich	NCLMIR001
MISSION  Lenti microRNA, Umano	Sigma-Aldrich	NCLMIR0001
Leica TCS SP5	Leica Microsystems
miRNeasy mini Kit	Qiagen	217004
TaqMan MicroRNA Kit di Trascrizione Inversa 1000 reazioni	ThermoFisher	4366597
has-mir-451a  RT/750 PCR rxns	ThermoFisher	001141
U6 snRNA	ThermoFisher	001973
TaqMan Universal Master Mix II, con UNG	ThermoFisher	4440038
StepOnePlus Sistema di PCR in tempo reale	ThermoFisher	4376600