Оценка функции внеклеточного пузырьков во время инфекции малярии
Summary
В этой работе мы описываем протоколы для расследования роли внеклеточных везикулы (EVs) выпущен в эритроцитах Plasmodium falciparum инфицированных. В частности мы сосредоточены на взаимодействии EVs с эндотелиальных клеток.
Abstract
Малярия — это болезнь, угрожающих жизни, вызванной Plasmodium паразитов, с P. falciparum наиболее распространенных на африканском континенте и ответственность за большинство случаев смерти, связанных с малярией во всем мире. Эволюция заболевания малярии инфицированных людей влияют несколько факторов, включая поглощение паразита в тканях, сосудистые дисфункции и воспалительные реакции. P. falciparum-зараженные красные кровяные клетки (iRBCs) релиз малых внеклеточного везикулы (EVs), содержащие различные виды грузов молекул, которые посредником патогенеза и сотовой связи между паразитов и хост. EVs, эффективно поглощаются клетки, в которых они модулировать их функции. Здесь мы обсуждаем стратегии для рассмотрения роли EVs в паразита хост взаимодействий. Во-первых мы опишем простой метод для маркировки и отслеживания EV интернализации эндотелиальных клеток, использованием компоновщика красителя Зеленые ячейки. Во-вторых мы приводим простой способ измерения проницаемости через эндотелиальные клетки однослойная с помощью дневно обозначенные декстрана. Наконец мы покажем, как расследовать роль малых молекул РНК-кодирования в функции эндотелиальных клеток.
Introduction
По данным Всемирной организации здравоохранения там были 212 миллионов новых случаев заболевания малярией во всем мире к 2015 году и приблизительно 429,000 человек погибло, главным образом детей младше пяти лет возраст1. Механизмы, ведущие к тяжелой болезни, которая часто ассоциируется с сосудистой дисфункции, остаются нечетко2. Plasmodium– iRBCs выделяют небольшие Би липидные мембраны сферах, известный как внеклеточного везикулы (EVs). Известно, что эти EVs потенциально имеющих отношение к процесс инфицирования и иммунного ответа к инфекции; Однако мало что известно о точной функции этих мелких пузырьков во время малярия инфекции3. Вполне возможно, что они играют две важные функции: с одной стороны, они могли бы содействовать патогенеза, активизируя макрофаги4,5; и с другой стороны, они могут быть посредником сотовой связи между паразитов и паразитов и разместить6,7. В самом деле паразиты могут передавать белки и нуклеиновые кислоты между друг с другом через EVs. К примеру Trypanosoma brucei rhodesiense EVs могут передавать фактор вирулентности Serum Resistance-Associated (SRA) и можно ориентировать другие т. brucei и принимающих эритроцитов8. Кроме того P. falciparum– iRBCs общаться друг с другом путем передачи нуклеиновых кислот в EVs. Это позволяет паразитов для оптимизации и синхронизировать ее роста. В самом деле EVs могут быть основной регулятор gametocyte преобразования и поэтому способствуют регуляции передачи этап7.
Не только сделать EVs регулировать паразитов, они также посредником паразит хост взаимодействий. Недавно мы обнаружили, что EVs от iRBCs содержат хост производные микроРНК (интерферирующим; малые РНК видов в диапазоне 21-25 нуклеотидов9), которые были приняты эндотелиальных клеток человека. Адаптивной в EVs образуют прочную комплекс с давности2 (членом РНК индуцированной глушителей комплекс), который после доставки на получателя ячейки, способен специально подавления экспрессии генов и затрагивающих барьерные свойства ячейки10. Были разработаны стандартные протоколы исследовать функцию EVs. Здесь мы сначала описать протокол, который позволяет люминесцентные маркировки EVs расследовать их усвоение клетками получателей. Кроме того с помощью конфокального микроскопа, можно проследить судьбу EV внутри клетки. Несколько флуоресцентных красителей могут использоваться для отслеживания EVs. Амин реактивных красителей, 5-(and-6)-Карбоксифлуоресцеина диацетата Succinimidyl эфира (CFSE) и Флуорексон-ам становится люминесцентные раз внутри везикул. Мы предпочитаем использовать метку амфифильных PKH, потому что он дает сигнал ярче и более равномерным. Этот подход обеспечивает важную информацию, чтобы понять взаимодействие между EVs и получателей клетки. Хотя в некоторых случаях EVs привязать к поверхности клеток, некоторые везикулы быстро take up. После поглощения EVs доставки их грузов в клетки, в которых они оказывают свои нормативные функции.
Здесь мы описываем протокол для измерения барьерной функции эндотелиальных клеток в пробирке путем определения количественных показателей передачи флуоресцентные декстран через сотовый монослоя. Более чувствительные Трейсеры может использоваться как radiolabeled маркеров. Однако они требуют особых мер предосторожности для использования. Другие анализы существуют для оценки функции барьера в пробирке , например трансэндотелиальной электрическое сопротивление (ТЕЕР), который измеряет туго Джанкшен целостности. Наконец визуализации ZO-1, белок плотный узел, с помощью иммунофлуоресцентного позволяет оценку целостности жесткие соединения как хорошо10. Так как EVs сложной и разнородной сущности, содержащие несколько грузов с потенциальными нормативной характеристикой, полезно overexpress конкретные РНК для изучения его воздействия на получателей ячейки. Таким образом мы также определить протокол, который направлен на создание стабильных клеточных линий, выражая Мирна интерес10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Некоторые паразиты, включая Токсоплазма, Трипаносомы, лейшмании и трихомонады вызвать освобождение EVs зараженных принимающей ячейки. В зависимости от патогенов выпущенные EVs можно модуляции иммунного ответа или посредником сотовой связи между паразитов6. Тем не менее сущ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансово поддержали частично Фондом Новартис лечебно – и биологических исследований (для ПИМ), Готфрид и Джулия Бангертера-Rhyner-Stiftung (чтобы МВт и ПИМ), и исследования пул Фрибургского университета (для ПИМ). Дополнительные гранты включают швейцарского правительства Excellence стипендии для иностранных ученых (ЗСБ и SM). Мы благодарим Isabelle Fellay и Соланж Kharoubi Hess за технической поддержкой.
Materials
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher – Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit | Biovision | K300-500 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions | ThermoFisher | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, with UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
Riferimenti
- WHO. . WHO Malaria Report 2015. , (2015).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).
- Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).
- Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727 (2016).
- Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
- Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).
- Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).
- Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
