Laboratoriet bolig av turkis killifish kan skaleres opp til huset og effektivt heve tusenvis av fisk i en sentralisert vann filtreringssystem, ansette de samme infrastrukturen brukes for standard sebrafisk fasiliteter. Her detalj vi en liste over standardisert prosedyrer som tillater effektiv killifish vedlikehold.
Utviklingen av dyrehold praksis i ikke-modellen laboratorium fisk for eksperimentelt bruk har stor nytte fra etablering av referanse fisk modellsystemer, som sebrafisk og medaka. De siste årene, har en voksende fisk-turkis killifish (Nothobranchius furzeri)-blitt adoptert av et økende antall forskningsgrupper innen biologi av aldring og økologi. Med en fange levetid 4-8 måneder, denne arten er shortest-lived virveldyr i fangenskap og lar det vitenskapelige samfunnet til test-på kort tid-eksperimentelle tiltak som kan føre til endringer av aldring rate og levealder. Gitt den unike biologien av denne arten, preget av embryonale diapause, merket eksplosive kjønnsmodning, morfologiske og atferdsmessige kjønnsdimorfisme- og deres relativt kort voksen levetid – adhoc dyrehold praksis er inne inntrengende etterspørselen. Denne protokollen rapporterer en rekke viktige dyrehold tiltak som tillater optimal turkis killifish laboratorium omsorg, slik vitenskapssamfunnet å vedta denne arten som kraftig laboratorium dyr modell.
Gitt sin korte levetid og rask livssyklus, er turkis killifish raskt økende som en lovende ny modell organisme i biologi1,2,3. Denne arten er preget av en unik livssyklus for en teleoster, bestående av embryonale diapause, rask kjønnsmodning og en utvidet post-reproductive liv stadium4,5. Nyere arbeid har bidratt til Klargjørende biologi av denne arten i fangenskap og i vill6,7. Turkis killifish bor i sesongens friske vann skjemaet under regntiden i den afrikanske savannen i Zimbabwe og Mosambik. I den tørre årstiden overleve embryo i tørr gjørma i fravær av vann i kraft av en stress-resistent livet scene kalt diapause.
Genetisk kart for denne arten vært generert8,9, og nylig sine genom er sekvensert og samlet10,11. Flere innavlet laboratorium fisk stammer har blitt utviklet, og transgenesis og genom redigering via CRISPR/Cas9 har blitt tilgjengelig i denne arten, de facto fremme turkis killifish som en konkurransedyktig laboratorium virveldyr modell organisme 12,13,14.
Selv om en laboratorium protokoll allerede er publisert i denne arten15, i stede protokollen utvikle vi en omfattende liste over eksperimentell laboratorium retningslinjer som er spesielt rettet mot studier som undersøker aldring og overlevelse. Nåværende protokollen gjør at forskere allerede kjent med sebrafisk og medaka rettsgrunnlag å bli kjent med turkis killifish dyrehold ved å vedta et minimum antall viktige justeringer. Samtidig gir denne protokollen forskere uten tidligere erfaring i fisk dyrehold med de grunnleggende verktøyene for å heve en blomstrende turkis killifish koloni.
Vi beskriver en protokoll for laboratoriet dyrking av turkis killifish, inkludert embryoet samling, inkubering, så vel som voksne fisk boliger, avl og fôring. Våre protokollen er spesielt rettet mot laboratorier som forske fokusert på voksen fisk, spesielt for eksperimentelle studier på aldring og levetid. Turkis killifish kan heves på en standard sebrafisk fasilitet; men avvike viktige aspekter killifish rettsgrunnlag fra standard sebrafisk omsorg16. Disse innstillingene inkluderer tidlig overgangen fra en saltlake reker eneste dietten til en diett med proteinrik blod orm, samt bestemte trinn i fosteret inkubasjonstiden, som består av en væske og tørr inkubasjon scene.
Avgjørende skritt i protokollen inkludere frakt embryo innenfor 8-30 ° C temperatur. Ved oppdrett avhenger fruktbarhet fôring frekvens og matkvalitet; Vi anbefaler derfor minst to feedings pr. dag per avl tanken å øke embryo kapasitet (se avsnitt 5.6.). Under embryoet bleking, går ikke utover embryoet inkubasjon i bleking løsningen. Dette kan forårsake skade på egg plasmocitara og økt embryoet dødelighet. Når rugende embryo med methylene blåfarge, ikke forlenge inkubering av klar-å-Luke embryo lenger enn 2 uker som sin levedyktighet reduseres dramatisk. Klekking turkis killifish, lav temperatur på humic sur løsning forbedrer klekking og komplett nedsenking av embryo i løsningen lar synkroniserte klekking. Ikke tilstrekkelig lufting under inkubasjon resultatene i høy forekomst av fry ikke kunne fylle gass blæren (“magen-slider” fenotype, se notater i pkt. 5.1).
Begrensning av protokollen for avl inkluderer bruk av sand underlaget som utgjør utfordringer til sentralisert filtreringssystemer og bør erstattes av alternative metoder i fremtiden. Mulige alternativer kan være bruk av sebrafisk avl tanker. Fosteret bleking kan forårsake store fysiske-kjemiske endringer i den egg plasmocitara som kunne føre til endrede plasmocitara fysiologi og klekking suksess. Konstant eksponering for embryoer methylene blåfarge kan indusere langsiktige endringer i voksen fisk fysiologi. Heve voksne fisk i personlige tanker for overlevelse Kohortstudier kan negativt påvirke fisk atferd og helse. Gruppe bolig for overlevelse Kohortstudier legger imidlertid til betydelig forvirrende faktorer på grunn av etableringen av sosiale dominans og mannlige territorier, fører til strenge sosiale hierarkier. Derfor dømme vi isolering av mannlige fisk for overlevelse studier som et rettferdig kompromiss. Fôring laboratorium killifish kolonier live mat fra FN-kontrollerte kilder legge en risiko for eksterne forurensing fra parasitter og potensielt patogene mikrobielle samfunn. I fremtiden, bør en ad hoc sterilt fiskefôr utvikles.
Fremtidige forbedringer til denne protokollen vil fokusere på en kontrollert, ikke-live diett, som fortsatt leder å fullføre kjønnsmodning innen 3-4 uker. Oppsummert tilbyr våre protokollen tilgjengelighet til turkis killifish laboratorium dyrking til et bredt vitenskapelige samfunn.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Alessandro Cellerino, Tyrone Genade, Anne Brunet, Sabrina Sharp, Mickie Powell, Simone Keil, Yumi Kim, Patrick Smith, Kai Mathar og alle medlemmer av Siezenheim laboratoriet ved Max Planck Institutt for biologi av aldring for å bidra til forskjellige aspekter gjeldende killifish dyrehold protokollen gjennom årene.
Probe calibration buffer solution pH=7.0 | Roth | A518.1 | 1L buffer solution pH=7.0 to calibrate water system pH-electrode |
Probe calibration buffer solution pH=4.0 | Roth | P712.1 | 1L buffer solution pH=4.0 to calibrate water system pH-electrode |
Conductivity standard | VWR | 83607.260 | 500 mL Conductivity standard 1,413 uS/cm to calibrate water system conductivity-electrode |
Easy Strips Test 6in1 | JBL | 2533900 | Test strips for determination chlorine values of system water |
Ammonia Test | JBL | 2536500 | Test to determine ammonia content of system water |
Red Sea Salt | Red Sea | 22 kg bucket | |
Sodium hydrogen carbonate | VWR | 27780.360 | |
Humic acid | Sigma- Aldrich | 53680-50G | |
New HUFA Artemia enrichment | ZM Systems UK | 75g bottle | |
Methylene blue | Roth | AE64.1 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma- Aldrich | 31642-1L | 30% (w/w) |
Cononut fiber | Dragon | ZCS010 | |
Whatman paper | GE healthcare | 3030-690 | |
Ethanol pure | VWR | 20821.467 | 100% |
Silica sand | local pet shop | ||
Artemia Eggs Premium Grade | Sanders | ||
Bloodworm | local distributor | Poseidon Aquakultur Germany | |
dNTPs solution mix | Biolabs | N04472 | 10mM |
Taq DNA polymerase | Invitrogen | 18038-042 | 5U/uL |
PCR 10x Buffer | Invitrogen | 18038-042 | |
MgCl2 | Invitrogen | 18038-042 | 50mM |
NaOH | Sigma- Aldrich | S8045-500g | 50mM |
Tris-HCl, pH=8.0 solution | Sigma- Aldrich | T2694-1L | 1M |
HCl 37% | Sigma- Aldrich | H1758-500mL | |
Aquatic housing system | Aquaneering | Central filtration equipped aquatic system | |
Fish tanks | Aquaneering | volume: 0.8L, 2.8L, 9.5L; equipped with baffles, fry mesh and lids | |
Orbital shaker | VWR | 89032-100 | model 5000 |
Microbiological incubator | Thermo Scientific, Heratherm | 50125882 | model IMC18; for storage embryos in the liquid phase, set to t=27-28°C |
Cooling Incubator | Binder | 9020-0209 | model KT115; for storage embryos in the solid phase, set to t=27-28°C |
Hatching incubator | Thermo Scientific, Heratherm | 51028114 | model OGS180; for embryos hatching, set to t=27-28°C |
Stereomicroscope | Leica | model M80 | |
Breeding sand/hatching boxes | Roth | 1598.1 | 1000mL |
Petri dish | Sarstedt | 82.1473 | 92x16mm |
50mL Conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
15mL Conical tube | Sarstedt | 62.554.002 | |
Disposable Plastic Pasteur pipette | Roth | EA71.1 | 2mL; For fish feeding with bloodworms, or embryos selection cut off the tip to open 3-4mm diameter |
Serological pipette | Sarstedt | 86.1689.001 | 50mL |
Syringe | Henke Sass Wolf | 4100-000V0 | 10mL |
Metal strainer | fineness <1mm; for embryos collection | ||
Tweezers | Dumont | 0508-5/45-PO | type5/45; for embryos transfer |
25L Brine shrimps hatcher | Aquaneering | ZHBS25 | main hatcher |
500mL Brine shrimps hatcher | JBL | 6106100 | model Artemio 1; backuo hatcher |
Narrow-mesh fish nets | JBL | ||
Sand beaker | VWR | BURK7102-5000 | 5000mL |
Brine shrimps separation beaker | VWR | BURK7102-2000 | 2000mL |
Plastic zipper bag | Roth | P279.2 | for dead fish storage |
Pipetboy | Integra | 155000 | model Pipetboy acu2 |
Parafilm | P-Lab | P701605 | |
Air tubing | www.zajac.de | AQ380 | 4-6 mm diameter |
1L Glass bottle | VWR | 215-1595 | |
2L Glass bottle | VWR | 215-1596 | |
500mL Squeeze bottle | Roth | K665.1 | for fish feeding with brine shrimps |
120 micron brine shrimps strainer | Florida Aqua Farms | BB-PC2 | for brine shrimps/bloodworm collection |
Finish filter socks | Aquaneering | MFVB025C | 25 micron |
Central filtration fish housing system | Aquaneering, Techniplast, Aquatic Habitats, Aqua Schwarz |