Un método sencillo y eficaz para la manipulación In Vivo de Gene cardiaco específico por inyección intramiocárdica en ratones
Summary
Aquí presentamos un protocolo para la manipulación de genes específicos cardiacos en ratones. Bajo anestesia, los corazones de ratón fueron externalizados a través del cuarto espacio intercostal. Posteriormente, adenovirus codificación genes específicos fueron inyectados con una jeringa en el miocardio, seguido por la medida de expresión de la proteína vía proyección de imagen en vivo y Western blot análisis.
Abstract
Manipulación de genes en el corazón significativamente potenciar la investigación de los pathomechanisms de la enfermedad cardiaca y su potencial terapéutico. En vivo entrega de gene cardiaco específico se logra comúnmente por la entrega ya sea sistémica o local. Inyección sistémica vía vena de la cola es fácil y eficiente en la manipulación de expresión génica cardiaca mediante el uso de virus adeno-asociado recombinante 9 (AAV9). Sin embargo, este método requiere una cantidad relativamente alta de vector para la transducción eficiente y puede resultar en la transducción de genes órgano no-objetivo. Aquí, describimos un método simple, eficiente y ahorro de tiempo de inyección intramiocárdica de en vivo manipulación gene cardiaco específico en los ratones. Bajo anestesia (sin ventilación), sin rodeos se disecaron los músculos pectorales mayores y menores, y el corazón de ratón rápidamente fue expuesto por externalización manual a través de una pequeña incisión en el cuarto espacio intercostal. Posteriormente, adenovirus codificación de luciferasa (Luc) y del receptor de vitamina D (VDR) u horquilla corto RNA (shRNA) dirigidos a VDR, fue inyectada con una jeringa Hamilton en el miocardio. Posterior en vivo la proyección de imagen demostró que luciferasa fue exitosamente sobreexpresado en el corazón. Además, el análisis de Western blot confirman la sobreexpresión exitosa o silenciamiento de VDR en el corazón de ratón. Una vez dominada, esta técnica puede utilizarse para la manipulación de genes, así como la inyección de las células u otros materiales como nanogels en el corazón de ratón.
Introduction
Enfermedad cardiaca es la principal causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo1,2. La falta de estrategias terapéuticas eficaces para enfermedades del corazón potencialmente mortales incluyendo infarto de miocardio e insuficiencia cardíaca atrae la exploración intensiva de pathomechanisms subyacentes y la identificación de nuevas opciones terapéuticas3. De estas exploraciones científicas, manipulación de genes cardíacos específicos es ampliamente utilizado4,5. Manipulación genética cardiaca puede lograrse mediante la edición del genoma con la nucleasa de efectoras como activador de transcripción potente (TALEN) y agrupadas regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) / CRISPR asociados proteína 9 (Cas9) herramientas, o por entrega de materiales genéticos ectópicas (p. ej., vectores de virus portadores de genes que codifican las proteínas de interés)6. Aunque la edición del genoma permite modificaciones del genoma exacto y espacio-temporales en ratones vivos, sigue siendo un desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva práctica6. Por otra parte, manipulación de genes cardíacos específicos al vector de virus o interferir pequeño entrega complejo RNA (siRNA) son habitualmente realizadas6.
Entrega de vectores de virus en el corazón de ratón adulto se logra aproximadamente dos estrategias: inyección local o sistémica. Inyección sistémica de cardiotropic serotipo de aireación como AAV9 es no invasiva para la manipulación de genes específicos cardiacos7. Sin embargo, este método requiere una cantidad relativamente alta de vectores necesarios para la transducción eficiente y expresión génica y puede resultar en significativa transducción de nontarget órganos como el músculo y el hígado7. Inyección local de virus se logra por inyección intramiocárdica o intracoronaria entrega7. Entrega intracoronaria conduce a una distribución más uniforme del virus dentro del corazón en comparación con la inyección intramiocárdica. Sin embargo, las desventajas de esta técnica son el lavado rápido fuera de vectores virales para la circulación sistémica y la transducción de señales en órganos no objetivo8y su exigencia de dispositivos para la medición de la presión durante la operación. Por el contrario, permite de inyección intramiocárdica mejor retención de virus en el miocardio, así como entrega de sitio específico, pero es incapaz de distribuir virus vector7. Para pequeños animales, entrega intracoronaria es técnicamente difícil de realizar, mientras que la inyección sistémica de AAV9 e inyección intramiocárdica más comúnmente practicado4,5,7. Aunque la inyección sistémica es fácil de realizar, inyección intramiocárdica convencional requiere toracotomía y ventilación mecánica, provoca daño tisular extenso y es desperdiciadora de tiempo.
En este informe, describimos un método fácil, ahorro de tiempo y muy eficiente para la inyección intramiocárdica. Codificación de luciferase y VDR o shRNA dirigido a VDR, adenovirus fue inyectado para manipular la expresión genética cardiaca. Una vez dominado, este método puede utilizarse para la manipulación de genes, así como la inyección de las células u otros materiales en el corazón de ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
El actual informe demuestra una técnica modificada para la inyección intramiocárdica de vectores virales para la manipulación de genes cardíacos, que fue modificada de un método para la inducción del infarto de miocardio por Gao et al. 13 actualmente en vivo caracterización de funciones gen específico suele implicar la generación de golpe de gracia o ratones transgénicos3,14,15</sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Fondo Nacional de ciencia de distinguidos jóvenes eruditos (81625002), Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (81470389, 81270282, 81601238), programa de Shanghai investigación líder académico (18XD1402400), Shanghai Municipal Apoyo de beca de educación Comisión Gaofeng medicina clínica (20152209), centro de desarrollo de Shanghai Shenkang Hospital (16CR3034A), Universidad de Shanghái Jiao Tong (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (15ZH1003 y 14XJ10019), Programa de navegación Shanghai (18YF1413000) y programa de posgrado de innovación de Bengbu Medical College (Byycx1722). Agradecemos a Dr. Erhe Gao por su ayuda anterior en nuestro laboratorio.
Materials
| Equipments | |||
| Laminar flow sterile hood | Fengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China) | FS-CJ-2F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 75005282 | |
| Tissue grinding machine | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Scientz-48 | |
| High temperature/high pressure sterilizer | Hirayama (Saitama, Japan) | HVE-50 | |
| Isoflurane vaporizer | Matrix (Orchard Park, USA) | VIP3000 | |
| IVIS Lumina III imaging system | PerkinElmer (Waltham, USA) | CLS136334 | |
| Precision balance | Sartorius (Göttingen, Germany) | 28091873 | |
| Instruments | |||
| Eppendorf pipette (100 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000059 | |
| Eppendorf pipette (10 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000113 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | JD4020 | Curved tip |
| Hamilton syringe | Hamilton (Nevada, USA) | 80501 | Volume 50 μL |
| Micro-mosquito hemostat | F.S.T (Foster City, USA) | 13011-12 | Curved, tip width 1.3mm |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | J32110 | |
| Surgical scissors | F.S.T (Foster City, USA) | 14002-12 | |
| 1-mL Syringe | WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China) | ||
| Materials and reagents | |||
| Anti-GAPDH antibody | CST (Danvers, USA) | #2118 | |
| Anti-Luciferase antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab187340 | |
| Anti-rabbit IgG | CST (Danvers, USA) | #7074 | |
| Anti-VDR antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab109234 | |
| Buprenorphine | Thermo Scientific (Waltham, USA) | PA175056 | |
| Chloralic hydras | LingFeng Chemical (ShangHai, China) | ||
| Cryogenic Vials | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 375418 | 1.8 mL |
| Depilatory cream | Veet (Shanghai, China) | ||
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco (Grand Island, USA) | 14040133 | |
| Entoiodine | LiKang (Shanghai, China) | 310132 | |
| EP tube | Sarstedt (Newton, USA) | PCR001 | |
| Filter | Millipore (Bedford, USA) | Pore size 0.2 µm | |
| Isoflurane | Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China) | ||
| Luciferin | Promega (Madison, USA) | P1041 | |
| Lysis buffer for western blot | Beyotime (Shanghai, China) | P0013J | Without inhibitors |
| Ophthalmic cream | Apex Laboratories ( Melbourne, Australia)) | ||
| PBS | Gibco (Grand Island, USA) | 10010023 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 78438 | |
| 5-0 silk suture | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | ||
| Steel ball | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Width 1.5 mm | |
| Syringe needle | Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China) | 30 gauge | |
| Warm mat | Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China ) | NF-GNCW | |
Riferimenti
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