Ekstraktion af Hemocytes fra Drosophila melanogaster larver for mikrobiel infektion og analyse
Summary
Denne metode viser, hvordan man visualisere patogen invasion i insekt celler med tre-dimensionelle (3D) modeller. Hemocytes fra Drosophila larver var smittet med virale eller bakterielle patogener, enten ex vivo eller i vivo. Inficerede hemocytes blev derefter fast og farvet for billeddannelse med en Konfokal mikroskop og efterfølgende 3D cellulære genopbygning.
Abstract
Under den patogene infektion i Drosophila melanogaster, spille hemocytes en vigtig rolle i immunresponset i hele infektionen. Målet med denne protokol er således, at udvikle en metode til at visualisere patogen invasion i en specifik immun rum af fluer, nemlig hemocytes. Ved hjælp af den metode, der præsenteres her, op til 3 × 10 kan6 live hemocytes fås fra 200 Drosophila 3rd instar larver i 30 min for ex vivo infektion. Alternativt kan hemocytes være inficeret i vivo gennem indsprøjtning af 3rd instar larver efterfulgt af hemocyte udvinding til 24 timer efter infektionen. Disse inficerede primærelementer blev fastsat, farves og afbildet ved hjælp af Konfokal mikroskopi. Derefter, 3D repræsentationer blev genereret fra billeder til endeligt Vis patogen invasion. Derudover høj kvalitet RNA for qRT-PCR kan fås til påvisning af patogenet mRNA følgende infektion og tilstrækkelig protein kan udvindes fra disse celler til vestlig skamplet analyse. Taget sammen, præsenterer vi en metode til konkret forsoning af patogenet invasion og bekræftelse af smitte ved hjælp af bakterielle og virale patogen typer og en effektiv metode til hemocyte udvinding for at få nok live hemocytes fra Drosophila larver for ex vivo og i vivo infektion eksperimenter.
Introduction
Drosophila melanogaster er en veletableret model organisme for studiet af medfødt immunitet1. Under den medfødte immunrespons spille hemocytes en vigtig rolle i svaret på patogen udfordring. Hemocytes er afgørende for indkapsling parasitter, samt at have en vigtig funktion i bekæmpelse af patogenet gennem fagocytiske aktion under svampe, virale og bakterielle infektion2,3.
For bedst forstå værtens medfødte immunresponset patogene mikrobielle infektioner, er det vigtigt at visualisere, hvordan patogenet invaderer værtsceller under infektion. Denne visualisering bidrager til en forståelse af mekanismen for invasion. Sammen med detaljer af patogenet intracellulære lokalisering og den cellulære reaktion, kan disse data give et fingerpeg om host reaktion på infektion og de cellulære organeller som mikrobe interagerer. Således er kan 3D model genopbygning efter billeddannelse ved mikroskopi være hjælpsomt at bestemme den nøjagtige placering af patogener i værtsceller. I denne undersøgelse visualiseret vi invasion af Coxiella burnetii (C. burnetii), det agens af Q-feber, en zoonotisk sygdom, der udgør en alvorlig trussel mod både menneskers og dyrs sundhed, i primære Drosophila hemocytes. For nylig, blev det påvist, at Drosophila er modtagelige for Biosikkerhed niveau 2 Nine Mile fase II (NMII) klon 4 stamme af C. burnetii og at denne stamme er i stand til at replikere i Drosophila4, der angiver, at Drosophila kan bruges som en model organisme for at studere C. burnetii patogenese.
Tidligere undersøgelser har brugt hemocytes til at undersøge værtens medfødte immunrespons. Hemocytes har været brugt til morfologiske observationer5,6,7, morfometrisk analyse2,8, fagocytose analyse2,3, qRT-PCR2 , 9, immunoprecipitation10,11, immunfluorescent analyse10,12, immunfarvning13, immunoblotting3,10, 11 og Immunhistokemi9,14. Selvom Drosophila S2 celler er også tilgængelige for forskellige in vitro- eksperimenter, ændre immortalization og potentielle allerede eksisterende virusinfektion deres opførsel15,16. Brug af primære celler i modsætning til en udødeliggjort cellelinie, såsom S2 celler, tillader for studiet af medfødte immun funktion i et system mere repræsentativ for hele organismen. Derudover tillader infektion af hemocytes i vivo, før udvinding, cellerne til at interagere med andre vært proteiner og væv, en fordel i forhold til udvinding af hemocytes før ex vivo infektion. En række forskellige metoder har været udnyttet til at opnå et tilstrækkeligt antal hemocytes i en kort periode af tid til at holde hemocytes i live8,17,18,19.
I denne undersøgelse præsenterer vi en metode til at udtrække hemocytes fra Drosophila 3rd instar larver for patogene mikrobiel infektion med C. burnetii, Listeria monocytogenes (Listeria) eller hvirvelløse iriserende virus 6 (IIV6). Vi beskriver metoder til både i vivo og ex vivo hemocyte infektioner. In vivo– og ex vivo-inficerede hemocytes blev visualiseret med Konfokal mikroskopi og bruges til at opbygge 3D-modeller af C. burnetii invasion. Derudover bruger udvinding protokol, ex vivo-inficerede hemocytes blev brugt til gen- og protein udtryk assays. Specifikt, for at undersøge omfanget af infektion med IIV6 og Listeria, blev total RNA eller protein isoleret fra cellerne for qRT-PCR eller Western blot analyse. Tilsammen, protokollen indeholder metoder til hurtigt at indsamle høje antal hemocytes fra 3rd instar larver og beviser at primære hemocytes, inficeret enten i vivo eller ex vivo, er en velegnet platform for mikrobielle patogen infektion og gældende downstream undersøgelsesfelt mikroskopi, transcriptomics og proteomics.
Protocol
Representative Results
Discussion
For bedre at forstå hvordan værtsceller bliver smittet, er det vigtigt at præcisere lokalisering af patogenet i cellerne, især når eksperimentere på tidligere uprøvet patogen og celle type kombinationer4. Mens studerer den cellulære reaktion kaskade efter infektion kan angive produktive patogen invasion, er kombinationen af imaging og cellulære svardata vigtigt at vise patogen invasion og infektion. Mens rapporter viser 2D billeder af patogenet invasion i værtsceller tendens til at angiv…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for Dr. Robert Heinzen for at give bestandene af mCherry-udtrykker Coxiella burnetii. Vi takker Dr. Luis Teixeira for hvirvelløse iriserende virus 6 og Bloomington Stock Center for at levere flyve bestande. Dette projekt var delvis finansieret af NIH grant R00 AI106963 (til A.G.G.) og Washington State University.
Materials
| Schneider's Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 21720024 | 1.1.1), 2.1.2) |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences (HyClone) | SH30070.03HI | 1.1.1), 2.1.2) |
| Filter (0.22 µL) | RESTEK | 26158 | 1.1.1) |
| Strainer (100 µm) | Greiner bio-one | 542000 | 1.2.1), 2) |
| Stereo microscope | Amscope | SM-1BSZ-L6W | 1.2), 2) |
| Glass capillary | Fisher Scientific | 21-171-4 | 1.1), 1.2), 2) |
| Capillary puller | Narishige International USA, Inc. | PC-10 | 1.1.3) |
| Mineral oil | Snow River Products | 1.1.4) | |
| Nanoinjector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | 1.1), 1.2), 2.2) |
| Forceps | VWR | 82027-402 | 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7) |
| CO2 delivery apparatus | Genesee Scientific | 59-122BC | 1.2), 2) |
| Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15250061 | 1.3) |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | 1.3) |
| 24 well plate | Greiner bio-one | 662160 | 1.4), 2.2) |
| Coxiella burnetii – mCherry | Dr. Heinzen, R. | 1.4), 2.2) | |
| Drosophila fruit juice plates | Cold Spring Harbor Protocols | 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | 2.1.1.1) |
| Methyl paraben | Amresco | 0572-500G | 2.1.1.2) |
| Absolute ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | 2.1.1.2) |
| Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL | Amazon | B0025UJVGM | 2.1.1.3) |
| Petri dishes, 10 x 35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | 2.1.1.4) |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-80 | 1.4.4), 2.2.2) |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 0210140001 | 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v) |
| Tungsten needle | Fine Science Tools | 10130-20 | 2.1) |
| Holding forceps | VWR | HS8313 | 2.1) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | FLO4042-500 | 3.1.3) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | 3.1.3) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | 3.1.3) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Thermo Fisher Scientific | 62247 | 3.1.4) |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | 3.1.6) |
| Confocal microsope | Leica | TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope | 3.2) |
| 3D imaging reconstruction software | Leica | LASX with 3D visualization module | 3.3) |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-3 | 3.1.6) |
| Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) | Dr. Teixeria, L. | 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008) | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | strain: 10403S | 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C. |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) | 18068015 | gDNA degradation |
| cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IIV6_193R_F | IDT | qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3' | |
| IIV6_193R_R | IDT | qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3' | |
| RpII_qRTPCR_fwd | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG | |
| RpII_qRTPCR_rev | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG | |
| SYBR Green qRT-PCR reagent | Thermo Fisher Scientific | K0251, K0252, K0253 | qRT-PCR |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107, 7500 Software v2.0 | qRT-PCR |
| Anti-Listeria monocytogenes antibody | abcam | ab35132 | Western blot |
| Anti-Actin antibody produced in rabbit | SIGMA-ALDRICH | A2066 | Western blot |
| Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate | Promega | W4011 | Western blot |
Riferimenti
- Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).
- Regan, J. C., et al. Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila. PLoS Pathog. 9 (10), 1003720 (2013).
- Yano, T., et al. Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila. Nat Immunol. 9 (8), 908-916 (2008).
- Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection. Infect Immun. 85 (7), (2017).
- Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster. PLoS One. 7 (4), 34721 (2012).
- Tsuzuki, S., et al. Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP. Nat Commun. 5, 4628 (2014).
- Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, 95-111 (2007).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
- Arefin, B., et al. Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State. PLoS One. 10 (8), 0136593 (2015).
- Rus, F., et al. Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells. Gene Expr Patterns. 6 (8), 928-934 (2006).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. P Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. P Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4805-4809 (2009).
- Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biol Open. 4 (3), 355-363 (2015).
- Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. P Natl Acad Sci USA. 101 (39), 14192-14197 (2004).
- Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses. P Natl Acad Sci USA. 106 (13), 5270-5275 (2009).
- Jovel, J., Schneemann, A. Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus. Virology. 419 (1), 43-53 (2011).
- Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J Vis Exp. (69), e4173 (2012).
- Sampson, C. J., Williams, M. J. Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses. Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).
- Nehme, N. T., et al. A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3 (11), 173 (2007).
- . Drosophila fruit juice egg plates. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2007).
- Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors. PLoS One. 11 (11), 0166088 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system. Virol Sin. 31 (2), 180-183 (2016).
- Rizki, T. M., Rizki, R. M. Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina. Dev Comp Immunol. 16 (2-3), 103-110 (1992).
- Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster. Immunol Lett. 101 (1), 108-111 (2005).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infect Immun. 84 (4), 1083-1091 (2016).
- Ozgen, A., et al. Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus. Virus Res. 189, 286-292 (2014).
- Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus. Virology. 286 (1), 182-196 (2001).
- Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole. Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).
- Liu, F., et al. Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro. Dev Comp Immunol. 36 (3), 619-628 (2012).
- De Gregorio, E., et al. An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila. Dev Cell. 3 (4), 581-592 (2002).
- Kari, B., et al. The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0150910 (2016).
- Wu, A. R., et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nat Methods. 11 (1), 41-46 (2014).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nat Biotechnol. 33 (2), 155-160 (2015).
- Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development. Genetica. 205 (2), 605-620 (2017).
- Yang, C. P., et al. Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting. Development. 143 (3), 411-421 (2016).
- Jaitin, D. A., et al. Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq. Cell. 167 (7), 1883-1896 (2016).
- Karaiskos, N., et al. The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution. Science. 358 (6360), 194-199 (2017).
