Extraction des hémocytes de larves de drosophile d’Infection microbienne et d’analyse
Summary
Cette méthode montre comment visualiser invasion de pathogènes dans les cellules d’insectes avec des modèles tridimensionnels (3D). Hémocytes de larves de drosophile étaient infectées par des pathogènes virus ou bactériens, ex vivo ou in vivo. Hémocytes infectés ont été ensuite fixe et teintés d’imagerie avec un microscope confocal et la reconstruction cellulaire 3D ultérieure.
Abstract
Au cours de l’infection pathogène de Drosophila melanogaster, hemocytes jouent un rôle important dans la réponse immunitaire tout au long de l’infection. Ainsi, l’objectif du présent protocole est de développer une méthode pour visualiser l’invasion d’agents pathogènes dans un compartiment spécifique immunitaire des mouches, à savoir les hémocytes. À l’aide de la méthode présentée ici, jusqu’à 3 × 106 hémocytes vivants peuvent provenir de 200 larves de stade Drosophila 3rd en 30 min pour infection ex vivo . Hémocytes peuvent également être infecté en vivo par injection 3rd des larves de stade suivi par extraction hémocytes d’infection après 24h. Ces cellules primaires infectés ont été fixés, colorés et imagés à l’aide de la microscopie confocale. Ensuite, des représentations 3D ont été générées à partir des images pour montrer définitivement invasion de pathogènes. En outre, ARN de haute qualité pour qRT-PCR peut être obtenue pour la détection des suivants d’ARNm pathogène infection et suffisamment de protéines peuvent être extraites de ces cellules pour analyse par Western blot. Ensemble, nous présentons une méthode pour la réconciliation définitive de l’invasion de l’agent pathogène et la confirmation de l’infection à l’aide de types d’agents pathogènes bactériens et viraux et une méthode efficace pour l’extraction de hémocytes d’obtenir assez hémocytes direct de drosophile larves d’expériences d’infection ex vivo et in vivo .
Introduction
Drosophila melanogaster est un organisme modèle bien établi pour l’étude de l’immunité innée1. Au cours de la réponse immunitaire innée, hemocytes jouent un rôle important dans la réponse au défi de l’agent pathogène. Hémocytes sont critiques pour encapsuler des parasites, comme ayant une fonction importante dans la lutte contre l’agent pathogène par l’action phagocytaire au cours de l’infection fongique, virale et bactérienne2,3.
Afin de mieux comprendre réponse immunitaire innée de l’hôte à l’infection microbienne pathogène, il est important de visualiser comment l’agent pathogène envahit les cellules de l’hôte au cours de l’infection. Cette visualisation contribue à la compréhension du mécanisme d’invasion. Ainsi que les détails de la localisation intracellulaire pathogène et la réponse cellulaire, ces données peuvent fournir des indices sur la réponse de l’hôte à l’infection et les organites cellulaires avec lequel interagit le microbe. Ainsi, reconstruction 3D modèle après l’imagerie par microscopie peut être utile pour déterminer l’emplacement précis d’agents pathogènes dans les cellules hôtes. Dans cette étude, nous avons visualisé l’invasion de Coxiella burnetii (c. burnetii), l’agent causal de la fièvre Q, une zoonose qui constitue une menace grave pour la santé humaine et animale, en primaires hémocytes de drosophile . Récemment, il a été démontré que les Drosophila sont susceptibles d’être du niveau de biosécurité 2 phase de Nine Mile II (NMII) cloner 4 souches de c. burnetii et que cette souche est capable de se répliquer dans drosophile4, indiquant que Drosophile peut être utilisé comme un organisme modèle pour étudier la pathogenèse de c. burnetii .
Des études antérieures ont utilisé les hémocytes pour étudier la réponse immunitaire innée chez l’hôte. Hémocytes ont été utilisés pour des observations morphologiques5,6,7, morphométriques analyse2,8, phagocytose analyse2,3, qRT-PCR2 , 9, immunoprécipitation10,11, analyse par immunofluorescence10,12, immunomarquage13, immunoblotting3,10, 11 et immunohistochimie9,14. Bien que les cellules de drosophile S2 sont également disponibles pour diverses expériences in vitro , immortalisation et infection virale préexistante potentielle changent leur comportement15,16. L’utilisation de cellules primaires par opposition à une lignée de cellules immortalisées, telles que les cellules S2, permet pour l’étude du système immunitaire inné dans un système plus représentative de l’ensemble de l’organisme. En outre, l’infection des hémocytes in vivo, avant l’extraction, permet aux cellules d’interagir avec d’autres protéines de l’hôte et le tissu, un avantage sur l’extraction de hemocytes avant l’ex vivo de l’infection. Un certain nombre de méthodes différentes ont été utilisé pour obtenir un nombre suffisant d’hémocytes dans un court laps de temps pour garder les hémocytes vivant8,17,18,19.
Dans cette étude, nous présentons une méthode pour extraire les hémocytes de drosophile 3rd stade larvaire pour infection microbienne pathogène avec c. burnetii, monocytogenes de Listeria (Listeria) ou invertébré irisé Virus 6 (IIV6). Nous décrivons les méthodes pour les infections hémocytes fois in vivo et ex vivo . In vivoet ex vivo-hémocytes infectés ont été visualisés à l’aide de la microscopie confocale et utilisées pour construire des modèles 3D de l’invasion de c. burnetii . En outre, en utilisant le protocole d’extraction, ex vivo-hémocytes infectées ont été utilisées pour l’expression génique et protéique des essais. Plus précisément, afin d’examiner l’étendue de l’infection avec IIV6 et Listeria, total ARN ou protéine a été isolé des cellules pour qRT-PCR ou analyse par Western blot. Pris ensemble, le protocole fournit des méthodes pour collecter rapidement un nombre élevé d’hémocytes de 3rd stade larvaire et les éléments de preuve que les hémocytes primaires, infecté soit in vivo ou ex vivo, sont une plate-forme appropriée pour microbienne études d’infection pathogène et des analyses en aval il y a lieu, comme la microscopie, transcriptomique et protéomique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour mieux comprendre comment sont infectent les cellules de l’hôte, il est important de préciser la localisation de l’agent pathogène dans les cellules, surtout quand l’expérimentation sur les pathogènes préalablement testés et cellule type combinaisons4. Alors qu’étudie la cascade de réaction cellulaire suite à une infection peut indiquer l’invasion pathogène productive, la combinaison des données de réponse cellulaire et d’imagerie est essentielle pour démontrer l’in…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à m. Robert Heinzen pour fournir des stocks d’exprimant le mCherry Coxiella burnetii. Nous remercions le Dr Luis Teixeira prévoyant la fourniture stocks de mouche de virus iridescent d’invertébrés 6 et le centre de Stock de Bloomington. Ce projet a été financé en partie par les NIH grant R00 AI106963 (à A.G.G.) et de la Washington State University.
Materials
| Schneider's Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 21720024 | 1.1.1), 2.1.2) |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences (HyClone) | SH30070.03HI | 1.1.1), 2.1.2) |
| Filter (0.22 µL) | RESTEK | 26158 | 1.1.1) |
| Strainer (100 µm) | Greiner bio-one | 542000 | 1.2.1), 2) |
| Stereo microscope | Amscope | SM-1BSZ-L6W | 1.2), 2) |
| Glass capillary | Fisher Scientific | 21-171-4 | 1.1), 1.2), 2) |
| Capillary puller | Narishige International USA, Inc. | PC-10 | 1.1.3) |
| Mineral oil | Snow River Products | 1.1.4) | |
| Nanoinjector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | 1.1), 1.2), 2.2) |
| Forceps | VWR | 82027-402 | 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7) |
| CO2 delivery apparatus | Genesee Scientific | 59-122BC | 1.2), 2) |
| Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15250061 | 1.3) |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | 1.3) |
| 24 well plate | Greiner bio-one | 662160 | 1.4), 2.2) |
| Coxiella burnetii – mCherry | Dr. Heinzen, R. | 1.4), 2.2) | |
| Drosophila fruit juice plates | Cold Spring Harbor Protocols | 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | 2.1.1.1) |
| Methyl paraben | Amresco | 0572-500G | 2.1.1.2) |
| Absolute ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | 2.1.1.2) |
| Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL | Amazon | B0025UJVGM | 2.1.1.3) |
| Petri dishes, 10 x 35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | 2.1.1.4) |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-80 | 1.4.4), 2.2.2) |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 0210140001 | 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v) |
| Tungsten needle | Fine Science Tools | 10130-20 | 2.1) |
| Holding forceps | VWR | HS8313 | 2.1) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | FLO4042-500 | 3.1.3) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | 3.1.3) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | 3.1.3) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Thermo Fisher Scientific | 62247 | 3.1.4) |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | 3.1.6) |
| Confocal microsope | Leica | TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope | 3.2) |
| 3D imaging reconstruction software | Leica | LASX with 3D visualization module | 3.3) |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-3 | 3.1.6) |
| Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) | Dr. Teixeria, L. | 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008) | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | strain: 10403S | 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C. |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) | 18068015 | gDNA degradation |
| cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IIV6_193R_F | IDT | qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3' | |
| IIV6_193R_R | IDT | qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3' | |
| RpII_qRTPCR_fwd | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG | |
| RpII_qRTPCR_rev | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG | |
| SYBR Green qRT-PCR reagent | Thermo Fisher Scientific | K0251, K0252, K0253 | qRT-PCR |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107, 7500 Software v2.0 | qRT-PCR |
| Anti-Listeria monocytogenes antibody | abcam | ab35132 | Western blot |
| Anti-Actin antibody produced in rabbit | SIGMA-ALDRICH | A2066 | Western blot |
| Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate | Promega | W4011 | Western blot |
Riferimenti
- Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).
- Regan, J. C., et al. Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila. PLoS Pathog. 9 (10), 1003720 (2013).
- Yano, T., et al. Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila. Nat Immunol. 9 (8), 908-916 (2008).
- Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection. Infect Immun. 85 (7), (2017).
- Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster. PLoS One. 7 (4), 34721 (2012).
- Tsuzuki, S., et al. Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP. Nat Commun. 5, 4628 (2014).
- Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, 95-111 (2007).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
- Arefin, B., et al. Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State. PLoS One. 10 (8), 0136593 (2015).
- Rus, F., et al. Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells. Gene Expr Patterns. 6 (8), 928-934 (2006).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. P Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. P Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4805-4809 (2009).
- Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biol Open. 4 (3), 355-363 (2015).
- Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. P Natl Acad Sci USA. 101 (39), 14192-14197 (2004).
- Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses. P Natl Acad Sci USA. 106 (13), 5270-5275 (2009).
- Jovel, J., Schneemann, A. Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus. Virology. 419 (1), 43-53 (2011).
- Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J Vis Exp. (69), e4173 (2012).
- Sampson, C. J., Williams, M. J. Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses. Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).
- Nehme, N. T., et al. A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3 (11), 173 (2007).
- . Drosophila fruit juice egg plates. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2007).
- Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors. PLoS One. 11 (11), 0166088 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system. Virol Sin. 31 (2), 180-183 (2016).
- Rizki, T. M., Rizki, R. M. Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina. Dev Comp Immunol. 16 (2-3), 103-110 (1992).
- Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster. Immunol Lett. 101 (1), 108-111 (2005).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infect Immun. 84 (4), 1083-1091 (2016).
- Ozgen, A., et al. Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus. Virus Res. 189, 286-292 (2014).
- Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus. Virology. 286 (1), 182-196 (2001).
- Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole. Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).
- Liu, F., et al. Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro. Dev Comp Immunol. 36 (3), 619-628 (2012).
- De Gregorio, E., et al. An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila. Dev Cell. 3 (4), 581-592 (2002).
- Kari, B., et al. The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0150910 (2016).
- Wu, A. R., et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nat Methods. 11 (1), 41-46 (2014).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nat Biotechnol. 33 (2), 155-160 (2015).
- Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development. Genetica. 205 (2), 605-620 (2017).
- Yang, C. P., et al. Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting. Development. 143 (3), 411-421 (2016).
- Jaitin, D. A., et al. Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq. Cell. 167 (7), 1883-1896 (2016).
- Karaiskos, N., et al. The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution. Science. 358 (6360), 194-199 (2017).
