Utvinning av Hemocytes från Drosophila melanogaster larver för mikrobiell infektion och analys
Summary
Denna metod visar hur att visualisera patogen invasion in i insekt celler med tredimensionella (3D) modeller. Hemocytes från Drosophila larver var infekterade med virus- eller bakterieinfektion patogener, antingen ex vivo eller in-vivo. Infekterade hemocytes var sedan fixeras och färgas för avbildning med en confocal mikroskopet och efterföljande 3D cellulära rekonstruktion.
Abstract
Under den patogena infektionen i Drosophila melanogaster, roll hemocytes en viktig i immunförsvaret i hela infektionen. Målet med detta protokoll är således att utveckla en metod för att visualisera den patogen invasionen i särskilda immun kupé av flugor, nämligen hemocytes. Metoden presenteras här, upp till 3 × 10 kan6 levande hemocytes erhållas från 200 Drosophila 3rd instar larver i 30 min för ex vivo infektion. Alternativt kan hemocytes vara smittade i vivo genom injektion av 3rd instar larver följt av hemocyte utvinning till 24 h efter infektion. Dessa infekterade primärceller fastställdes, målat och avbildas med konfokalmikroskopi. Sedan genererades 3D representationer från bilderna att slutgiltigt Visa patogen invasion. Dessutom hög kvalitet RNA för qRT-PCR kan erhållas för upptäckt av patogen mRNA följande infektion och tillräckligt protein kan extraheras från dessa celler för Western blot analys. Sammantaget presenterar vi en metod för bestämd försoning av patogen invasion och bekräftelse av smitta med bakteriella och virala patogener typer och en effektiv metod för extraktion av hemocyte för att erhålla tillräckligt levande hemocytes från Drosophila Larverna för ex vivo och in-vivo infektion experiment.
Introduction
Drosophila melanogaster är en väletablerad modellorganism för studien av medfödd immunitet1. Under medfödda immunsvaret roll hemocytes en viktig i att bemöta patogen utmaning. Hemocytes är kritiska för encapsulating parasiter, samt ha en viktig funktion i att bekämpa patogener genom fagocytreaktion under svamp, viral och bakteriell infektion2,3.
För att bäst förstå värdens medfödda immunsvaret mot patogena mikrobiella infektioner, är det viktigt att visualisera hur patogenen invaderar värdceller vid infektion. Denna visualisering bidrar till en förståelse av mekanismen för invasion. Tillsammans med Detaljer för patogen intracellulära lokalisering och cellulära svar, kan dessa uppgifter ge ledtrådar om den värd reaktion på infektion och cellulära organeller som mikrob interagerar. Således, 3D modell återuppbyggnad efter avbildning av mikroskopi kan vara bra att bestämma den exakta platsen för patogener i värdceller. I denna studie var visualiserat vi invasionen av Coxiella burnetii (C. burnetii), vilka smittämnen av Q-feber, en zoonotisk sjukdom som utgör ett allvarligt hot mot både människors och djurs hälsa, in i primära Drosophila hemocytes. Nyligen, det visades att Drosophila är mottagliga för biosäkerhet nivå 2 Nine Mile fas II (NMII) klona 4 stam av C. burnetii och att denna stam är kunna replikera i Drosophila4, som anger att Drosophila kan användas som modellorganism för att studera C. burnetii patogenes.
Tidigare studier har använt hemocytes för att undersöka värdens medfödda immunsvar. Hemocytes har använts för morfologiska iakttagelser5,6,7, morfometriska analys2,8, fagocytos analys2,3, qRT-PCR2 , 9, immunoprecipitation10,11, Immunofluorescerande analys10,12, immunfärgning13, immunoblotting3,10, 11 och immunohistokemi9,14. Även om Drosophila S2 celler är också tillgängliga för olika in vitro- experiment, ändra immortalization och potentiella redan existerande virusinfektion deras beteende15,16. Användning av primära celler i motsats till en förevigade cellinje, såsom S2 celler, tillåter för studien av medfödda immunförsvaret i ett system mer representativa för hela organismen. Dessutom kan infektionen av hemocytes i vivo, före extraktion, cellerna att interagera med andra värd proteiner och vävnad, en fördel över utvinning av hemocytes före ex vivo infektion. Ett antal olika metoder har använts för att erhålla ett tillräckligt antal hemocytes i en kort tidsperiod att hålla hemocytes vid liv8,17,18,19.
I denna studie presenterar vi en metod för att extrahera hemocytes från Drosophila 3rd instar larver för patogena mikrobiell infektion med C. burnetii, Listeria monocytogenes (Listeria) eller ryggradslösa djur skimrande virus 6 (IIV6). Vi beskriver metoderna för både i vivo och ex vivo hemocyte infektioner. In vivo– och ex vivo-infekterade hemocytes var visualiserat med konfokalmikroskopi och används för att skapa 3D-modeller av C. burnetii invasion. Dessutom använda protokollet utvinning, ex vivo-infekterade hemocytes användes för gen- och protein uttryck analyser. Specifikt, för att undersöka omfattningen av infektion med IIV6 och Listeria, isolerades totalt RNA eller proteiner från cellerna för qRT-PCR eller Western blot analys. Sammantaget protokollet ger metoder för att snabbt samla in kick numrerar av hemocytes från 3rd instar larver och bevis att primär hemocytes, infekterade antingen i vivo eller ex vivo, är en lämplig plattform för mikrobiell patogen infektion studier och tillämpliga nedströms analyser t.ex mikroskopi, transkriptomik, proteomik.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att bättre förstå hur värdceller blivit smittad, är det viktigt att klargöra localizationen av patogenet i cellerna, särskilt när experimentera på tidigare oprövade patogen och cell typ kombinationer4. Medan studera cellulära svar kaskad efter infektion kan indikera produktiva patogen invasion, är kombinationen av bilddata och cellulära svarsdata väsentliga att demonstrera patogen invasion och infektion. Medan rapporter visar 2D-bilder av patogen invasion in i värdceller tender…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma till Dr Robert Heinzen för att tillhandahålla bestånd av mCherry-uttryckande Coxiella burnetii. Vi tackar Dr. Luis Teixeira för att tillhandahålla ryggradslösa skimrande virus 6 och Bloomington lager Center för att tillhandahålla flyga bestånd. Projektet var delvis finansierad av NIH grant R00 AI106963 (till A.G.G.) och Washington State University.
Materials
| Schneider's Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 21720024 | 1.1.1), 2.1.2) |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences (HyClone) | SH30070.03HI | 1.1.1), 2.1.2) |
| Filter (0.22 µL) | RESTEK | 26158 | 1.1.1) |
| Strainer (100 µm) | Greiner bio-one | 542000 | 1.2.1), 2) |
| Stereo microscope | Amscope | SM-1BSZ-L6W | 1.2), 2) |
| Glass capillary | Fisher Scientific | 21-171-4 | 1.1), 1.2), 2) |
| Capillary puller | Narishige International USA, Inc. | PC-10 | 1.1.3) |
| Mineral oil | Snow River Products | 1.1.4) | |
| Nanoinjector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | 1.1), 1.2), 2.2) |
| Forceps | VWR | 82027-402 | 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7) |
| CO2 delivery apparatus | Genesee Scientific | 59-122BC | 1.2), 2) |
| Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15250061 | 1.3) |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | 1.3) |
| 24 well plate | Greiner bio-one | 662160 | 1.4), 2.2) |
| Coxiella burnetii – mCherry | Dr. Heinzen, R. | 1.4), 2.2) | |
| Drosophila fruit juice plates | Cold Spring Harbor Protocols | 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | 2.1.1.1) |
| Methyl paraben | Amresco | 0572-500G | 2.1.1.2) |
| Absolute ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | 2.1.1.2) |
| Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL | Amazon | B0025UJVGM | 2.1.1.3) |
| Petri dishes, 10 x 35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | 2.1.1.4) |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-80 | 1.4.4), 2.2.2) |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 0210140001 | 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v) |
| Tungsten needle | Fine Science Tools | 10130-20 | 2.1) |
| Holding forceps | VWR | HS8313 | 2.1) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | FLO4042-500 | 3.1.3) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | 3.1.3) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | 3.1.3) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Thermo Fisher Scientific | 62247 | 3.1.4) |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | 3.1.6) |
| Confocal microsope | Leica | TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope | 3.2) |
| 3D imaging reconstruction software | Leica | LASX with 3D visualization module | 3.3) |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-3 | 3.1.6) |
| Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) | Dr. Teixeria, L. | 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008) | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | strain: 10403S | 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C. |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) | 18068015 | gDNA degradation |
| cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IIV6_193R_F | IDT | qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3' | |
| IIV6_193R_R | IDT | qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3' | |
| RpII_qRTPCR_fwd | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG | |
| RpII_qRTPCR_rev | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG | |
| SYBR Green qRT-PCR reagent | Thermo Fisher Scientific | K0251, K0252, K0253 | qRT-PCR |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107, 7500 Software v2.0 | qRT-PCR |
| Anti-Listeria monocytogenes antibody | abcam | ab35132 | Western blot |
| Anti-Actin antibody produced in rabbit | SIGMA-ALDRICH | A2066 | Western blot |
| Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate | Promega | W4011 | Western blot |
Riferimenti
- Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).
- Regan, J. C., et al. Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila. PLoS Pathog. 9 (10), 1003720 (2013).
- Yano, T., et al. Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila. Nat Immunol. 9 (8), 908-916 (2008).
- Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection. Infect Immun. 85 (7), (2017).
- Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster. PLoS One. 7 (4), 34721 (2012).
- Tsuzuki, S., et al. Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP. Nat Commun. 5, 4628 (2014).
- Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, 95-111 (2007).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
- Arefin, B., et al. Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State. PLoS One. 10 (8), 0136593 (2015).
- Rus, F., et al. Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells. Gene Expr Patterns. 6 (8), 928-934 (2006).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. P Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. P Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4805-4809 (2009).
- Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biol Open. 4 (3), 355-363 (2015).
- Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. P Natl Acad Sci USA. 101 (39), 14192-14197 (2004).
- Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses. P Natl Acad Sci USA. 106 (13), 5270-5275 (2009).
- Jovel, J., Schneemann, A. Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus. Virology. 419 (1), 43-53 (2011).
- Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J Vis Exp. (69), e4173 (2012).
- Sampson, C. J., Williams, M. J. Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses. Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).
- Nehme, N. T., et al. A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3 (11), 173 (2007).
- . Drosophila fruit juice egg plates. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2007).
- Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors. PLoS One. 11 (11), 0166088 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system. Virol Sin. 31 (2), 180-183 (2016).
- Rizki, T. M., Rizki, R. M. Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina. Dev Comp Immunol. 16 (2-3), 103-110 (1992).
- Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster. Immunol Lett. 101 (1), 108-111 (2005).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infect Immun. 84 (4), 1083-1091 (2016).
- Ozgen, A., et al. Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus. Virus Res. 189, 286-292 (2014).
- Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus. Virology. 286 (1), 182-196 (2001).
- Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole. Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).
- Liu, F., et al. Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro. Dev Comp Immunol. 36 (3), 619-628 (2012).
- De Gregorio, E., et al. An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila. Dev Cell. 3 (4), 581-592 (2002).
- Kari, B., et al. The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0150910 (2016).
- Wu, A. R., et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nat Methods. 11 (1), 41-46 (2014).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nat Biotechnol. 33 (2), 155-160 (2015).
- Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development. Genetica. 205 (2), 605-620 (2017).
- Yang, C. P., et al. Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting. Development. 143 (3), 411-421 (2016).
- Jaitin, D. A., et al. Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq. Cell. 167 (7), 1883-1896 (2016).
- Karaiskos, N., et al. The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution. Science. 358 (6360), 194-199 (2017).
