Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) Histon ändringar från Saccharomyces cerevisiae
Summary
Här beskriver vi ett protokoll för kromatin immunoprecipitation av modifierade histoner från spirande jästen Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA används därefter för kvantitativ PCR för att förhöra överflöd och lokalisering av Histon post-translationella modifieringar i hela genomet.
Abstract
Histon post-translationella modifieringar (PTMs), såsom acetylering, metylering och fosforylering, regleras dynamiskt av en rad enzymer som Lägg till eller ta bort dessa märken som svar på signaler tas emot av cellen. Dessa PTMS är nyckelpersoner till regleringen av processer såsom gen uttryck kontroll och DNA reparation. Kromatin immunoprecipitation (chIP) har varit en instrumental tillvägagångssätt för dissekera överflöd och lokalisering av många Histon PTMs i hela genomet som svar på olika störningar till cellen. Här beskrivs en mångsidig metod för att utföra post-translationally modifierade histoner-chIP från spirande jästen Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) . Denna metod förlitar sig på crosslinking av proteiner och DNA använder formaldehyd behandling av jäst kulturer, generation av jäst lysates av pärla slå, lösbarhet av kromatin fragment av micrococcal nuclease och immunoprecipitation Histon-DNA komplex. DNA är associerad med varumärket Histon sevärdheter renas och föremål för kvantitativa PCR-analys att utvärdera dess anrikning på flera loci i hela genomet. Representativa experiment sondera localizationen av Histon varumärkena H3K4me2 och H4K16ac i vildtyp och muterade jäst diskuteras för att Visa dataanalys och tolkning. Denna metod är lämplig för en mängd Histon PTMs och kan utföras med olika muterade stammar eller i närvaro av olika miljöpåfrestningar, vilket gör det till ett utmärkt verktyg för att undersöka förändringar i kromatin dynamik under olika förhållanden.
Introduction
Dynamiska posttranslationella modifieringen (PTM) av histoner är en viktig reglerande mekanism för många DNA-mallade processer, inklusive transkription, replikering och DNA reparation1,2. Möjligheten att bestämma överflöd och exakt lokalisering av modifierade histoner samtidig med dessa processer är därför avgörande för att förstå deras reglering under olika förhållanden i cellen. Utvecklingen av kromatin immunoprecipitation (chIP) som en metod som till stor del härrörde från biokemiska studier av interaktioner mellan proteiner och DNA, bestämt in vitro- metoder med kemiska bindemedel, tillsammans med behovet av att utvärdera den dynamiska karaktär av protein-DNA interaktioner i vivo och på specifika regioner av genomet3,4,5. Befordran av kvantitativ PCR (qPCR) och sekvensering teknik har också utökat möjligheten att utföra chIP experiment med kvantitativa jämförelser och över hela genomet, vilket gör det ett kraftfullt verktyg för dissekera DNA-protein interaktioner på flera nivåer.
För närvarande är chIP en lämplig metod för alla intresserade av kromatin-medierad reglering av genomet forskargrupp som det finns inga jämförbara metoder för direkt förhör den fysiska kopplingen mellan en modifierad Histon och en specifik genomisk locus i vivo. Även om det finns varianter av denna metod som använder nästa generations sekvensering mappa Histon ändringar i hela genomet6,7 , kan dessa synsätt behandla olika vetenskapliga frågor och deras skala, kostnad och tekniska resurser kan vara begränsande för vissa forskargrupper. Dessutom riktade chIP-qPCR är nödvändigt att komplettera dessa metoder genom att tillhandahålla metoder både optimera chIP protokollet före sekvensering och att validera resultaten från epigenetisk datamängderna. Masspektrometri baserad metoder för att identifiera full uppsättning av Histon märken förknippas med genomiska regioner har också dykt upp8,9,10,11, dock dessa metoder har vissa begränsningar angående vilka regioner i genomet kan vara utforskad och de kräver teknisk expertis och instrumentering som inte kommer att vara tillgängliga för alla forskargrupper. ChIP förblir därför en grundläggande metod för att analysera överflöd och distribution av Histon ändringar under varierande förhållanden för alla forskargrupper intresserad epigenetik, kromatin och regleringen av genomisk funktioner.
Här, beskriver vi en metod för chIP med spirande jästen modell Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) för att undersöka fördelningen av Histon PTMs på kromatin. Denna strategi bygger på ett antal centrala delarna av chIP protokoll utvecklad i jäst och också tillämpas på olika modell system12,13. Interaktioner mellan modifierade histoner och DNA i cellen bevarade av crosslinking med formaldehyd. Efter lysate beredning, kromatin fragment är solubilized i enhetligt medelstora fragment av matsmältning med micrococcal nuclease. Immunoprecipitation av modifierade Histonerna utförs med antingen kommersiella eller lab-genererade antikroppar och eventuella associerade DNA är isolerade och analyseras för berikning på särskilda genomisk regioner med qPCR (figur 1). För många Histon modifieringar räcker mängden DNA som erhållits från detta protokoll för att testa mer än 25 olika genomisk loci av qPCR.
Detta chIP metod är mångsidig för att övervaka distribution av en enstaka Histon ändring på flera mutant stammar eller miljöförhållanden, eller för att testa flera Histon ändringar i vildtyp celler på ett antal genetiska loci. Dessutom är många komponenter i protokollet enkelt justerbar att optimera upptäckt av antingen högt – eller ödmjuk-riklig Histon-märken. Slutligen ger utför chIP av modifierade histoner i spirande jäst möjlighet att använda viktiga kontroller för antikropp specificitet som till stor del inte är tillgängliga i andra system. Nämligen jäststammar kan genereras som bär punktmutationer i Histon rester som är avsedda för modifiering, och, i vissa fall finns det bara ett enda enzym som katalyserar ändring på en viss Histon rester (t.ex. Histon lysin metyltransferaser). Därför kan chIP utföras i antingen Histon mutant eller enzym radering stammar till assay i omfattning som icke-specifik bindning av antikroppen kan förekommande och generera falskt positiva resultat. Denna kontroll är särskilt värdefulla för nyutvecklade antikroppar, och kan även användas för att validera antikropp specificitet för bevarade Histon ändringar före deras användning i andra system. Detta synsätt kompletterar andra metoder för att testa antikropp specificitet som skiljer mellan olika modifiering stater (t.ex. mono-, di- och tri-metylering), inklusive sondera matriser av modifierade peptider och utföra western blotting av histoner eller nucleosomes med definierade ändringar. Övergripande, chIP i spirande jäst är en kraftfull metod för att bedöma dynamiken i Histon PTMs i hela genomet och dissekera de mekanismer som styr deras reglering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Proceduren som beskrivs här möjliggör effektiv återvinning av DNA som är associerad med modifierade histoner i jästceller av immunoprecipitation. Detta följs av qPCR med primers som förstärker regioner av intresse att bestämma lokala anrikning eller utarmning av specifika Histon ändringar. Trots att utvecklas som en metod för nästan 20 år sedan, fortfarande chIP definierande analysen för att utreda Histon ändring status på olika genomisk regioner och under olika förhållanden. Även om chIP kopplat till…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka medlemmarna i gröna lab för bra diskussioner. Detta arbete stöds delvis av NIH grants R03AG052018 och R01GM124342 till E.M.G.
Materials
| Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
| Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
| Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
| NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
| 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
| MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
| LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
| Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
| 25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
| Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
| Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
| Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
| Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
| BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
| α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
| α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
| α H3 | Abcam | ab1791 | |
| α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
| High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
| Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
| magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
| Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
| 2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
| Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |
Riferimenti
- Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate. J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and combinatorial functions of histone modifications. Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Lefrançois, P., et al. Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing. BMC Genomics. 10, 37 (2009).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
- Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Meluh, P. B., Broach, J. R. Immunological analysis of yeast chromatin. Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).
- Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).
- Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).
- Briggs, S. D., et al. Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae. Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).
- Bernstein, B. E., et al. Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes. P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).
- Pokholok, D. K., et al. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell. 122 (4), 517-527 (2005).
- Krogan, N. J., et al. The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation. Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).
- South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A. P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).
- Margaritis, T., et al. Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3′-end antisense transcription. PLoS Genet. 8 (9), e1002952 (2012).
- Jezek, M., et al. The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance. Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).
- Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin. Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).
- Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).
- Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
