Frazionamento per la risoluzione delle specie di huntingtina solubili e insolubili

Summary

Un metodo è descritto per il frazionamento delle specie solubili e insolubili huntingtina mutata dalla coltura delle cellule e del cervello del mouse. Il metodo descritto è utile per la caratterizzazione e la quantificazione del flusso di proteina huntingtina ed aids nell'analizzare omeostasi della proteina nella patogenesi della malattia e in presenza di perturbazioni

Abstract

L'accumulo di proteine misfolded è centrale per la patologia nella malattia di Huntington (HD) e molte altre patologie neurodegenerative. In particolare, una caratteristica patologica chiave di HD è l'aberrante accumulo della proteina mutante HTT (mHTT) in complessi ad alto peso molecolare e i corpi di inclusione intracellulari è composto da frammenti e altre proteine. I metodi convenzionali per misurare e comprendere che i contributi delle varie forme di mHTT contenenti aggregati includono microscopia a fluorescenza, l'analisi western blot e filtro trappola saggi.

Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono conformazione specifica e pertanto non può risolvere lo stato di cambiamento continuo della proteina mHTT a causa della natura complessa di aggregazione solubilità e la risoluzione completa.

Per l'identificazione di mHTT aggregati e varie forme modificate e complessi, separazione e solubilizzazione degli aggregati cellulari e frammenti è obbligatorio. Qui descriviamo un metodo per isolare e visualizzare mHTT solubile, monomeri, oligomeri, frammenti, e un insolubile ad alto peso molecolare (HMW) accumulato mHTT specie. HMW mHTT tracce con progressione di malattia, corrisponde con le letture di comportamento del mouse e ha stato favorevolmente modulata da determinati interventi terapeutici¹. Questo approccio può essere utilizzato con cervello di topo, tessuti periferici e coltura delle cellule, ma può essere adattato ad altri sistemi di modello o contesti di malattia.

Introduction

L'interruzione delle reti di controllo di qualità di proteina che assicurano il corretto ripiegamento e degradazione delle proteine cellulari è probabile centrale per la patologia nel morbo di Alzheimer (annuncio), malattia di Parkinson (MDP), malattia di Huntington (HD) e altri "misfolding proteico" disordini di^2,3. Conoscere in dettaglio i componenti di rete proteostasis e i loro contributi alla patologia sono quindi cruciali per lo sviluppo di interventi terapeutici migliorati. MH è causata dall'espansione anormale di una ripetizione di CAG nel gene HD risultante in un tratto espanso di polyglutamines (poli....

Protocol

Dichiarazione etica animale - esperimenti sono stati effettuati in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health e un protocollo di ricerca animale approvato dalla (uso Comitato e istituzionali Animal Care IACUC) presso la University of California, Irvine, un AAALAC accreditata istituzione. Tutti gli sforzi sono stati fatti per minimizzare la sofferenza animale.

1. preparazione del buffer di lisi

1. Preparare "Solubile" buffer di lisi (Tris 10 mM pH 7.4, 1% Triton X 100, 150 mM NaCl, 10% glicerolo) e filtro sterile attraverso il filtro di 0,22 µm.
   1. Per un buffer di lisi....

Results

Risoluzione di lisati solubili e insolubili, seguito di frazionamento può essere rilevato tramite occidentale saggi di ritardo analisi e filtro (Figura 2). Ad esempio, cellule HEK293T transfected utilizzando il reagente di transfezione (ad es., lipofectamine 2000), con l'esone HTT 1 codifica cDNA contenenti glutammina 97 ripete¹⁵ seguita dalla regione ricca di prolina di poli e queste cellule sono state permesse espresso per 4.......

Discussion

Alcune precauzioni sono necessarie per i protocolli di cui sopra garantire risultati coerenti e quantitativi. In primo luogo, mHTT in entrambe le frazioni formeranno spontaneamente aggregati nel tempo su cicli ripetuti di congelamento scongelamento, specialmente quando ci si trova in alta concentrazione. È dunque fondamentale per congelare le aliquote di preps la proteina e scongelare solo il volume necessario prima di eseguire il test come descritto nel protocollo di cui sopra. Ulteriormente, se la frazione insolubile p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filtro sterile	Millipore	SCGP505RE	Tappo a vite, filtro sterile per vuoto
1 mL Macinatore di tessuti, Dounce	Wheaton	357538
Sonicator	Qsonica	Modello Q125
DC Protein Assay	Biorad	5000111	Paragonabile al test Lowry
Soluzione tampone Tris 1M	Alfa Aesar	J60636
Triton X-100	Fisher	BP151-100
NaCl 5M soluzione	Teknova	S0251
Glicerolo	Fisher	BP229-1
20% SDS soluzione	Teknova	S0295
N-etilmaleimmide	Sigma	E1271
Fenilmetilsulfonio fluoruro	Sigma	P7626	creare 100mM soluzione madre in 100% EtOH, negozio a 4 gradi C
Ortovanadato di sodio	Sigma	S6508	Creare una soluzione madre da 0,5 M in acqua
Leupeptin	Sigma	L2884	Creare una soluzione madre da 10 mg/ml in acqua
Aprotinina	Sigma	A1153	Creare una soluzione madre da 10 mg/ml in acqua
Fluoruro di sodio	Sigma	S4504	Creare una soluzione madre da 500 mM in acqua
Anti-HTT	Millipore	MAB5492	Utilizzare 1:1000 per western blot, 1:500 per il test di ritardo del filtro
Anti-GAPDH	Novus Biologicals	NB100-56875	Utilizzare 1:1000 per western blot solubile