Frazionamento per la risoluzione delle specie di huntingtina solubili e insolubili
Summary
Un metodo è descritto per il frazionamento delle specie solubili e insolubili huntingtina mutata dalla coltura delle cellule e del cervello del mouse. Il metodo descritto è utile per la caratterizzazione e la quantificazione del flusso di proteina huntingtina ed aids nell’analizzare omeostasi della proteina nella patogenesi della malattia e in presenza di perturbazioni
Abstract
L’accumulo di proteine misfolded è centrale per la patologia nella malattia di Huntington (HD) e molte altre patologie neurodegenerative. In particolare, una caratteristica patologica chiave di HD è l’aberrante accumulo della proteina mutante HTT (mHTT) in complessi ad alto peso molecolare e i corpi di inclusione intracellulari è composto da frammenti e altre proteine. I metodi convenzionali per misurare e comprendere che i contributi delle varie forme di mHTT contenenti aggregati includono microscopia a fluorescenza, l’analisi western blot e filtro trappola saggi.
Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono conformazione specifica e pertanto non può risolvere lo stato di cambiamento continuo della proteina mHTT a causa della natura complessa di aggregazione solubilità e la risoluzione completa.
Per l’identificazione di mHTT aggregati e varie forme modificate e complessi, separazione e solubilizzazione degli aggregati cellulari e frammenti è obbligatorio. Qui descriviamo un metodo per isolare e visualizzare mHTT solubile, monomeri, oligomeri, frammenti, e un insolubile ad alto peso molecolare (HMW) accumulato mHTT specie. HMW mHTT tracce con progressione di malattia, corrisponde con le letture di comportamento del mouse e ha stato favorevolmente modulata da determinati interventi terapeutici1. Questo approccio può essere utilizzato con cervello di topo, tessuti periferici e coltura delle cellule, ma può essere adattato ad altri sistemi di modello o contesti di malattia.
Introduction
L’interruzione delle reti di controllo di qualità di proteina che assicurano il corretto ripiegamento e degradazione delle proteine cellulari è probabile centrale per la patologia nel morbo di Alzheimer (annuncio), malattia di Parkinson (MDP), malattia di Huntington (HD) e altri “misfolding proteico” disordini di2,3. Conoscere in dettaglio i componenti di rete proteostasis e i loro contributi alla patologia sono quindi cruciali per lo sviluppo di interventi terapeutici migliorati. MH è causata dall’espansione anormale di una ripetizione di CAG nel gene HD risultante in un tratto espanso di polyglutamines (poliQ) nella proteina huntingtina (HTT)4. Una caratteristica patologica coerenza della patogenesi dell’HD è il misfolding risultante, accumulo e l’aggregazione di HTT in regioni del cervello e nei tessuti periferici, che ha dimostrato di interferire in vari modi con funzione e omeostasi cellulare normale 5 , 6. HTT mentre è espressa ubiquitariamente, neuroni medi spinosi nello striato sono selettivamente vulnerabili e più apertamente interessata con atrofia corticale notevole anche associato con la patogenesi dell’HD.
La formazione di aggregati di HTT nel cervello di pazienti con MH e modelli animali in genere ha servito come un marcatore di proxy per la progressione della malattia e dominante-negativo guadagno di funzione per mHTT7. Anche se i meccanismi precisi di quale proteina misfolding e aggregazione può contribuire alla tossicità indotta da mHTT rimangono poco chiari, la formazione di queste inclusioni nel cervello dei pazienti di HD e vari modelli animali è una caratteristica invariante e inevitabile. Inclusioni appaiono per essere composto in gran parte accumulate HTT frammenti contenenti il N-terminale ampliato polyQ, indicando tale proteolisi ed elaborazione di Full-Length HTT, nonché8,di splicing alternativo9 possono svolgere un ruolo importante nella patogenesi della HTT HD. N-terminale frammenti può costituire una forma patologica di HTT che può aggregare rapidamente, nucleazione e accelerare o propagare il processo di aggregazione10.
Tuttavia, la presenza di queste inclusioni non è necessariamente correlata con la tossicità indotta da HTT o cellule morte11. HTT è stato proposto di sottoporsi a un processo di aggregazione da un monomero solubile attraverso specie oligomeriche solubile e β-foglio fibrille di aggregati insolubili e inclusioni12. Risoluzione di queste varie specie di proteina tramite saggi biochimici standard è stata una sfida nel campo grazie alla loro stabilità nel buffer di lisi di basso-detergente e difficoltà nel visualizzare utilizzando saggi biochimici standard. Così, considerazioni metodologiche sono fondamentali nel rilevare il grado e il modello di mHTT accumulati e aggregati.
Il protocollo qui presentato fornisce un metodo per visualizzare diversi intermedi di HTT, in particolare la formazione di una specie di HMW HTT insolubile che sembra tenere sotto controllo con HD patogenesi e malattia progressione1,13 ,14. Essere in grado di risolvere e tenere traccia di più specie di mHTT fornisce ai ricercatori uno strumento biochimico per studiare la patogenesi della malattia e per valutare potenziali interventi terapeutici attraverso la modulazione e l’impatto sulla patogenesi della malattia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alcune precauzioni sono necessarie per i protocolli di cui sopra garantire risultati coerenti e quantitativi. In primo luogo, mHTT in entrambe le frazioni formeranno spontaneamente aggregati nel tempo su cicli ripetuti di congelamento scongelamento, specialmente quando ci si trova in alta concentrazione. È dunque fondamentale per congelare le aliquote di preps la proteina e scongelare solo il volume necessario prima di eseguire il test come descritto nel protocollo di cui sopra. Ulteriormente, se la frazione insolubile …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal NIH (RO1-NS090390). Vorremmo anche ringraziare il Dr. Joan Steffanfor assistenza tecnica e discussione durante lo sviluppo di questo test.
Materials
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
Riferimenti
- Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington’s Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
- La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
- Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington’s disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
- The Huntington’s Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington’s disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington’s disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
- Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington’s disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington’s disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
- Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington’s Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
- Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington’s disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
- Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington’s disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307 (2017).
- Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington’s disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
- Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
- Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington’s Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
- O’Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
- Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
- Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
- Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
- Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington’s disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
- Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73 (2009).
- Shahmoradian, S. H., et al. TRiC’s tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
- Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).
