中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング
Summary
この方法論の全体的な目標は、固定細胞における微小管、中間径フィラメントの 2D デュアル カラー dSTORM イメージを実行するために、画像の獲得および復興にサンプル準備から最適な実験条件を与えるには
Abstract
アクチン フィラメント、微小管、中間径フィラメント (場合) から成る骨格はセルの形状、極性・細胞運動の制御に重要な役割を果たしています。微小管とアクチン ネットワークの組織が広く研究されていますが、IFs のまだ完全に特徴付けられない。IFs は、細胞の細胞質に広がるネットワーク 10 nm とフォームの平均直径を有する。アクチンと微小管分子モーター、細胞骨格のリンカーを物理的に関連付けられています。このタイトな関連付けは、ほとんどの細胞機能に必要な 3 つの細胞骨格ネットワークの連携制御機構を確保する規制メカニズムの核心です。したがって、If だけで、また一緒にそれぞれの他の骨格のネットワークを可視化することが重要です。ただし、場合ネットワークはほとんどの細胞の種類、グリア細胞の特に中に非常に密な解像度に標準の蛍光顕微鏡と達成するために非常に困難なる (~ 250 の解像度を横 nm)。直接確率光再建顕微鏡 (dSTORM) はゲイン 1 桁の水平解像度で可能にする技法です。ここでは、横 dSTORM 解像度ある場合ネットワークの特に、もし束周囲の微小管の密な組織を解決するための十分なことを示します。このような緊密な関連が説明する、これら 2 つのネットワークの連携制御機構に参加する可能性がどのようにビメンチン IFs テンプレートと微小管の組織を安定させると同様、微小管依存の小胞輸送に影響を与える可能性があります。もっと一般に、デュアル カラー dSTORM 技術 2 つの細胞骨格成分の観測が彼らの相互作用に新しい洞察力をもたらす方法を示す.
Introduction
細胞の中間径フィラメント (IFs) は、直径 10 nm のヒト – または場合蛋白質の特定のサブセットを携帯型の heteropolymers です。IFs は、細胞運動、増殖やストレス応答など細胞機能の広い範囲に参加します。その重要な役割が 90 以上の人間の病気直接場合蛋白質で突然変異によって引き起こされるという事実によって強調表示されます。例えば、腫瘍の増殖および1,2,3を広める場合組成の変化を伴います。細胞の極性形成、部門と移行2,3などの細胞機能を制御する共同で 3 つの骨格システムが働くという証拠が高まっています。建築の空間と機能の間の密結合なので、他のフィラメントの場合の構造への洞察力を得るし、細胞骨格のクロストークを理解することが重要です。この記事は、超解像技術のデュアル カラー dSTORM (直接確率再建顕微鏡)4との間の相互作用を調査する使用方法と微小管を実行するプロトコルを提供しますで固定、培養2 次元 (2 D) 内のセル。
いくつかの超解像技術は、過去に開発されている年とそこ発見 2014年5ノーベル化学賞の原点であった。これらすべての方法の間であるパーム6 (Photo-Activated ローカリゼーション顕微鏡) スイッチング蛍光タンパク質を使用して嵐7 fluorophores が付いてまたは dSTORM4 のペアのような単一分子局在に基づく方法従来 fluorophores が付いています。ローカライズするためにこれらすべてのメソッドは、「オフ」状態に (i) 蛍光レポーターのほとんどのスイッチから成っている同じ原理に基づいています」(非蛍光灯)、(ii) それらのサブセットを蛍光の確率論的活性化状態のナノメートル精度、および (iii) できるだけ fluorophores の多くのサブセットをアクティブにするためにこのプロセスの繰り返しと空間的な位置。最終的なイメージは、20 ~ 40 までの横方向の分解能を提供する活性化分子のすべてのローカライズを使用して再構築されます nm。パーム/嵐をできるようにいくつか商品化された光学系のルーチンの実験のための生物学者に今あります。ここでは、1 つのようなシステムは微小管と IFs の結合構造を研究に使用されました。非常に薄い層状の領域を観察する最適ですのですべて単一分子局在ベースのメソッドの間でデュアル カラー dSTORM 手法が選ばれた (< 1 μ m) 付着性のセルの画像解像度の大幅な改善を提供することができます、最小限の時間とお金の投資。確かに、dSTORM は、細胞染色と蛍光抗体法により定期的に使用される標準的な有機色素と互換性がある非常に便利な汎用性の高いテクニックです。
限られている場合は特に、選択バッファーに正しく 2 つの染料が点滅する場合もあるので、実験の条件を最適化する必要がありますデュアル カラー dSTORM 1色 dSTORM 画像は Alexa6478蛍光体を使用して取得する比較的簡単なレーザー パワー。優秀な論文は dSTORM9,10、11,12,13, マルチカラー イメージングをセットアップする方法に使用されておりこれらの書類は、詳細に説明の可能なソース成果物と劣化画像の解像度だけでなく、それらを克服する方法。この記事は、細胞の固定、染色、サンプル準備の面で最適な実験条件、画像取得と画像再構成が密な細胞質場合ネットワークと微小管の画像を得るために説明デュアル カラー dSTORM とグリア細胞。簡単に言えば、Chazeau ら12の抽出/固定方法がグリア細胞に適応されポスト固定ステップ、最適化された抗体濃度で使用、10 ミリメートルと嵐バッファー MEA の記載したデンプシー9ら実験のセットアップとサンプル タイプに最適なことが判明します。
グリア細胞は主に 3 種類の場合はタンパク質を表現: ビメンチン、ネスチンと GFAP (グリア細胞の酸性タンパク質の線維性)。これらの 3 つのタンパク質は、アストロ サイト14共重合に示されていた。我々 は以前超解像の構造化照明顕微鏡 (SR SIM) 同じ単一の場合フィラメントのこれらの 3 つの場合の蛋白質を見つけることができます、グリア細胞15と同様の分布と動態表示ことを示した。3 の場合蛋白質の間の類似点のため全体の場合ネットワークの腔は使用レポーターとして。DSTORM を使用すると、回折では不可能でしたが微小管に沿って場合フォーム バンドルが顕微鏡技術15に限られた解決することができた。これらの観察は、ビメンチン IFs にテンプレート微小管ことができる方法を理解し、彼らの成長の軌道の細胞移行16中極性軸の整備を推進を規制できます。超解像画像 2 つの細胞骨格サブシステムの相互作用に重要な情報を提供し、空間協会とセル型特定17となるローカル関数間のリンクへの洞察力をもたらした。一般に、密度と特異性の面で条件が良い染色に達した、デュアル カラー dSTORM を骨格要素やその他の細胞小器官間のクロストークを勉強する使用できます。この手法は膠芽腫と星の中に、細胞骨格の変化を特徴付けるより役に立つでしょう、最も一般的なと最も悪性の腫瘍の場合蛋白質の表現が、中枢神経系の変更18 、19,20,21。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルの重要なステップ
微小管の dSTORM 画像内のアーティファクトとグリア細胞における IFs を最小にするプロトコルをご紹介します。サンプル準備およびイメージ投射の各ステップでの成果物を作成できます: 固定、ブロック、反応、ドリフトの買収により、非最適な点滅条件23。我々 は、最も重要な手順以下リストします。
<p clas…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ミカエル ・ Lelek、オレシティス Faklaris と有意義な議論のニコラス ・城下町、アンドレイ Aristov と超解像技術のヘルプについてエレナ練とシャイラージャ ・ Seetharaman 原稿の注意深い読書のために感謝します感謝するフランス国立研究機関 (ANR 10 INSB 04; サポート フランス バイオ イメージング インフラストラクチャ ネットワークと同様、UtechS フォトニック バイオ イメージング (Imagopole) Citech のパスツール研究所 (パリ, フランス)未来への投資)、および地方イル (ドメーヌ d プログラム ‘ 水利 Majeur Malinf) Elyra 顕微鏡の使用のため。この仕事に支えられ、リーグ Contre le がんとフランス国立研究機関 (ANR-16-CE13-0019)。
Materials
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 41090-028 | cell culture |
| non essential amino acid | Gibco | 1140-050 | cell culture 1/100e |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | cell culture 1/100e |
| Fœtal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | cell culture 1/10e |
| 0,05 % Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | cell culture |
| PBS 10x | fischer scientific | 11540486 | cell culture |
| coverslip 18 mm n°1,5H | Marienfield/Dominic dutsher | 900556 | coverslips |
| paraformaldehyde (PFA) solution | Sigma | F8775 | cell fixation |
| glutaraldehyde | Sigma | G5882 | cell fixation |
| triton X100 | Sigma | T9284 | non ionic surfactant. Used for cell fixation |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | 452904-25ML | cell fixation |
| BSA | Sigma | A7906 | sample passivation 3% in PBS |
| Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse | Sigma | V6630 | primary antibodies |
| Rat anti alpha tubulin | Biorad | MCA77G | primary antibodies |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Fisher scientific | 10635923 | secondary antibodies |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Fisher scientific | 10226162 | secondary antibodies |
| TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Fisher scientific | T7279 | fluorescent beads |
| Chamlide magnetic chamber | Live Cell Instrument | CM-B18-1 | magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL |
| Cysteamine (MEA) | Sigma | 30070 | for the blinking buffer |
| glucose oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G0543 | for the blinking buffer |
| glucose | sigma | for the blinking buffer | |
| catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | for the blinking buffer |
| Tris (trizma) | Sigma | T1503 | for the blinking buffer |
| Wash-N-Dry coverslip rack | Sigma | Z688568 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | paraffin film |
| ultrasonic cleaner | Fisher scientific | 15-335-6 | |
| plasma cleaner | Harrick plasma | PDC-32G-2 |
Riferimenti
- Herrmann, H., Aebi, U. Intermediate Filaments: Structure and Assembly. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).
- Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up. Curr Opin Cell Biol. 32, 39-47 (2015).
- Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects. Curr Opin Cell Biol. 32, 102-112 (2015).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Gevaux, D. Nobel Prize in Chemistry: seeing the nanoscale. Nat Nanotechnol. 9 (11), 878 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test samples for optimizing STORM super-resolution microscopy. J Vis Exp. (79), (2013).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Dempsey, G. T. A user’s guide to localization-based super-resolution fluorescence imaging. Methods Cell Biol. 114, 561-592 (2013).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Chazeau, A., Katrukha, E. A., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Studying neuronal microtubule organization and microtubule-associated proteins using single molecule localization microscopy. Methods Cell Biol. 131, 127-149 (2016).
- Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).
- Eliasson, C., et al. Intermediate filament protein partnership in astrocytes. J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).
- Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization. J Cell Biol. 216 (6), 1689-1703 (2017).
- Gan, Z., et al. Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration. Cell Syst. 3 (5), 500-501 (2016).
- Nieuwenhuizen, R. P., et al. Co-Orientation: Quantifying Simultaneous Co-Localization and Orientational Alignment of Filaments in Light Microscopy. PLoS One. 10 (7), e0131756 (2015).
- Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).
- Maslehaty, H., Cordovi, S., Hefti, M. Symptomatic spinal metastases of intracranial glioblastoma: clinical characteristics and pathomechanism relating to GFAP expression. J Neurooncol. 101 (2), 329-333 (2011).
- Hol, E. M., Pekny, M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system. Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).
- Skalli, O., et al. Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins. Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).
- Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).
- Whelan, D. R., Bell, T. D. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5, 7924 (2015).
- Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers. PLoS One. 8 (7), e69004 (2013).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nat Commun. 6, 7933 (2015).
- Nieuwenhuizen, R. P., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
- Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).
