तीन आयामी प्रतिपादन और Immunolabeled का विश्लेषण, स्पष्ट मानव अपरा Villous संवहनी नेटवर्क
Summary
इस अध्ययन प्रतिवर्ती ऊतक समाशोधन, immunostaining, 3 डी प्रतिपादन और मानव अपरा विल्ली नमूनों में संवहनी नेटवर्क के विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल 1-2mm3 के आदेश पर प्रस्तुत करता है ।
Abstract
माता और भ्रूण के बीच पोषक तत्व और गैस विनिमय मातृ intervillous रक्त के इंटरफेस पर होता है और विशाल villous केशिका नेटवर्क है जो मानव अपरा के पैरेन्काइमा को ज्यादा बनाता है । बाहर villous केशिका नेटवर्क नाल गर्भनाल से बाहर का विस्तार जहाजों की शाखाओं में बंटी की कई पीढ़ियों के बाद भ्रूण रक्त की आपूर्ति के टर्मिनस है । इस नेटवर्क में एक निरंतर सेलुलर म्यान, syncytial trophoblast बाधा परत है, जो भ्रूण रक्त और मातृ रक्त में यह लगातार स्नान किया जाता है के मिश्रण से बचाता है । अपरा केशिका नेटवर्क की अखंडता के लिए अपमान, इस तरह के मातृ मधुमेह, उच्च रक्तचाप और मोटापे के रूप में विकारों में होने वाली, भ्रूण, शिशु, और वयस्क के लिए गंभीर स्वास्थ्य जोखिम मौजूद है कि परिणाम है. बेहतर इन अपमान के संरचनात्मक प्रभाव को परिभाषित करने के लिए, एक प्रोटोकॉल इस अध्ययन है कि 1-2mm 3 के आदेश पर केशिका नेटवर्क संरचना कब्जा है जिसमें एक अपनी पूरी जटिलता में अपनी टोपोलॉजिकल सुविधाओं की जांच कर सकते है के लिए विकसित किया गया था । यह पूरा करने के लिए, अपरा से टर्मिनल विल्ली के समूहों को विच्छेदित कर रहे हैं, और trophoblast परत और केशिका endothelia immunolabeled हैं । इन नमूनों तो एक नया ऊतक समाशोधन प्रक्रिया है जो यह संभव z करने के लिए फोकल छवि स्टैक प्राप्त करने के लिए बनाता है के साथ स्पष्ट कर रहे हैं ~ 1 मिमी की गहराई. इन ढेर के तीन आयामी renderings तो संसाधित कर रहे है और विश्लेषण के लिए मूल केशिका नेटवर्क उपाय जैसे मात्रा, केशिका शाखाओं की संख्या, और केशिका शाखा अंत अंक, के लिए इस दृष्टिकोण की उपयुक्तता के सत्यापन के रूप में उत्पंन केशिका नेटवर्क लक्षण वर्णन ।
Introduction
अपरा विकासशील और उसके विकृतियों की हमारी समझ है, बड़े माप में, आसंन विल्ली और निहित केशिकाओं ऊतकवैज्ञानिक वर्गों से व्युत्पंन के बीच आस्थगित स्थानिक संबंधों को सीमित । इस अध्ययन में, हम मानव अपरा केशिका नेटवर्क है कि केशिका नेटवर्क सुविधाओं (जैसे शाखाकरण, ठोसता) के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है के तीन आयामी (3 डी) प्रतिपादन उत्पंन करने के लिए साधन विकसित करके इस मुद्दे को संबोधित किया है । ऐसा करने के लिए हम दो वाणिज्यिक ऊतक समाशोधन उत्पादों, Visikol-1 और Visikol-2 के साथ धुंधला immunofluorescent संयुक्त है (समाधान के रूप में नीचे निर्दिष्ट-1 और समाधान-2) ।
मानव अपरा मां के intervillous रक्त और विकासशील भ्रूण के बीच इंटरफेस पर स्थित रक्त वाहिकाओं का एक विशाल परिसर है । chorionic प्लेट में अपनी प्रविष्टि से बाहर का विस्तार, धमनियों और नसों के एक नेटवर्क है कि ramify एक विस्तृत संवहनी नेटवर्क के साथ chorionic सतह को कवर करने के लिए गर्भनाल शाखाओं में । उनके सिरों तो आंतरिक या अपरा डिस्क की गहराई में नीचे घुसना, जहां वे कई और शाखाओं में पीढ़ियों और अंत टर्मिनल विल्ली और उनके निहित केशिका नेटवर्क से गुजरना, गैसों, पोषक तत्वों के आदान प्रदान की साइट, और चयापचय भ्रूण और मातृ रक्त के बीच अपशिष्ट ।
विकास के दौरान अपरा केशिका नेटवर्क के लिए अपमान भ्रूण, नवजात शिशु और आकस्मिक वयस्क 1,2,3के स्वास्थ्य के लिए स्थाई परिणाम है । गर्भपात, अंतर्गर्भाशयी वृद्धि प्रतिबंध, पूर्व प्रसवाक्षेप और मातृ मधुमेह के रूप में गर्भावस्था से संबंधित विकृतियों को ध्यान में रखते हुए 4,5,6 वहाँ माप के तरीकों के विकास पर रखा एक उच्च मूल्य है और अपरा villous केशिका नेटवर्क का लक्षण वर्णन । एक प्रमुख अंधी गली है कि अपरा संवहनी नेटवर्क पैमाने की एक व्यापक रेंज शामिल है । सतह संवहनी नेटवर्क व्यास में 4-5 मिमी के रूप में के रूप में महान हो सकता है । टर्मिनल villous केशिकाओं व्यास में 10 -20 µm के आदेश पर कर रहे हैं; अपरा रक्त वाहिकाओं के 300 से अधिक 7किमी होता है । वर्तमान में, वहां कुछ उपयोग करने के लिए आसान है और तेजी से तकनीक है कि पोत पैमाने के इन अतिवाद पर कब्जा कर सकते हैं । तिथि करने के लिए, केवल विल्ली की एक छोटी संख्या माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदान किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, Jirkovska एट अल. अपरा अंकुर पर शब्द पर ध्यान केंद्रित, धारावाहिक ऑप्टिकल वर्गों के साथ 1 µm अंतराल 120 µm मोटी वर्गों से प्राप्त पर फोकल माइक्रोस्कोपी के संयोजन; नमूनों की संख्या पर कोई डेटा नहीं अध्ययन किया गया और न ही आंकड़े 8प्रदान किए गए थे. केशिका संरचनाओं की पहचान की गई, और विल्ली और केशिकाओं की आकृति हाथ से तैयार की गई, छवि विश्लेषण के लिए निर्यात अनुरेखण के साथ थे । जबकि लेखक “बढ़ती villous संवहनी नेटवर्क” के लिए अपने निष्कर्षों के निहितार्थ पर चर्चा, ऐसे निष्कर्ष समस्याग्रस्त है जब केवल “शब्द” (36 + सप्ताह गर्भावधि उंर) ऊतक का अध्ययन किया है । इसी तरह, मेयो एट एएल और Pearce एट अल. रक्त प्रवाह और ऑक्सीजन हस्तांतरण के अपने सिमुलेशन के लिए, एक ही उम्र के ऊतकों पर भरोसा किया, लेकिन उनके विश्लेषण केवल कुछ शब्द तक ही सीमित थे, टर्मिनल विल्ली 9,10 . Stereology भी villous जहाजों की संरचना के अध्ययन के लिए लागू किया गया है । लेकिन फिर, ध्यान आम तौर पर एक या एक से अधिक गर्भावस्था जटिलताओं 11,12के साथ liveborn शिशुओं को वितरित बाद में गर्भधारण पर किया गया है ।
हाल ही में जब तक, फोकल माइक्रोस्कोपी की वजह से उत्तेजना और प्रतिदीप्ति के उत्सर्जन के अवशोषण की वजह से १००-२०० µm के ऊतक गहराई को इमेजिंग करने के लिए सीमित था 13 । हालांकि ऊतक समाशोधन और 3 डी प्रोटोकॉल व्यापक रूप से साहित्य में वर्णित किया गया है और वहां ऊतक समाशोधन के लिए कई तरीके है सामांय में ऊतकों के साथ प्रयोग के लिए अनुपयुक्त हैं, के रूप में वे hyperhydration के माध्यम से अचल क्षति सेलुलर आकृति विज्ञान प्रोटीन या लिपिड को हटाने की । इसलिए, यह संभव है कि इन परिणामों के ऊतक ही नहीं है और हमारे ऊतक समाशोधन प्रक्रिया जबकि प्रसंस्करण से कलाकृतियों का संकेत कर रहे है कि एक प्रतिवर्ती तकनीक है कि पारंपरिक प्रोटोकॉल के खिलाफ मांय करने में सक्षम है मांय नहीं है । ऊतक समाशोधन आम तौर पर तीन प्रमुख दृष्टिकोण में से एक शामिल है: 1) डुबकी द्वारा आरआई मिलान समाधान में ऊतक घटकों के अपवर्तन सूचकांक (आरआई) के समान मिलान, जो संचयी प्रकाश बिखरने की वजह से लेंस से निकलती निरंतर कम आरआई (cytosol) और उच्च आरआई (प्रोटीन/लिपिड) घटक के उतार-चढ़ाव; 2) hydrogel में embedding के माध्यम से लिपिड घटकों को हटाने और ट्रो का उपयोग/लिपिड घटकों को हटाने के लिए प्रसार; 3) विकार/प्रोटीन संरचना के विस्तार की अनुमति के लिए सॉल्वैंट्स की पैठ में वृद्धि आरआई की एकरूपता को प्रोत्साहित करने के लिए 13। हालांकि इन तरीकों के ऊतकों को पारदर्शी प्रदान कर सकते है और के लिए अनुमति के 3 डी अभ्यावेदन के लिए उत्पंन हो, इन 3 डी अभ्यावेदन संदिग्ध नैदानिक मूल्य के है क्योंकि यह निर्धारित अगर इन छवियों ऊतक गुणों का संकेत कर रहे है चुनौतीपूर्ण है या ऊतक समाशोधन प्रक्रिया की । दूसरी ओर, के बाद से हमारे ऊतक समाशोधन प्रतिवर्ती मानक ऊतकवैज्ञानिक और/या immunohistochemistry एक ही ऊतक के लिए लागू किया जा सकता है मूल्यांकन करने के लिए कि परिवर्तन नैदानिक महत्वपूर्ण हैं ।
इस अध्ययन के 47 बाहर villous नमूने के एक कुल से प्राप्त की एक विश्लेषण प्रस्तुत करता है 23 नैदानिक सामांय और वैकल्पिक 9-23 पूरा ‘ सप्ताह हमल और दो पूर्ण अवधि के सामांय प्रसव के बीच गर्भधारण समाप्त । trophoblast और endothelia के इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग villous संवहनी नेटवर्क और उनकी जटिलता में परिवर्तन का एक मात्रात्मक और स्वचालित विश्लेषण सक्षम है ।
इस प्रोटोकॉल के साथ, हम अलग और पहले से संभव नहीं पैमाने पर टर्मिनल विल्ली और उनके केशिका नेटवर्क का विश्लेषण किया । इस दृष्टिकोण, जब villous और गर्भावधि भर में केशिका नेटवर्क विकास के लिए लागू उन संपत्तियों है कि एक स्वस्थ बच्चे के जंम के लिए नींव है की पहचान करेगा । जब जटिल गर्भधारण के अध्ययन के लिए आवेदन किया, यह भी स्पष्ट है जब और कैसे अपरा विकृतियों villous पेड़ और केशिका नेटवर्क वे म्यान, और कैसे भ्रूण भलाई पर इन को बदलने को संशोधित करेगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
संस्थागत समीक्षा बोर्ड ने ऐच्छिक रूप से समाप्त गर्भधारण से formalin निर्धारण के लिए अपरा villous ऊतकों के संग्रह को मंजूरी दी. इससे पहले कि प्रक्रियाओं, चिकित्सा रिकॉर्ड की एक संक्षिप्त समीक्षा प्रदर्शन किया ग?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम विकास विकलांग और अपरा विश्लेषिकी LLC, नई रोशेल, NY के साथ लोगों के लिए ंयूयॉर्क राज्य कार्यालय द्वारा समर्थित किया गया ।
Materials
| 10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer | Macron Fine Chemicals | H-121-08 | General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic |
| Scalpel blades | ThermoFisher Scientific | 08-916-5B No. 11 | |
| Scalpel | ThermoFisher Scientific | 08-913-5 | |
| Fine forceps | Electron Microscopy Services | 78354-119 | |
| Micro Tube (1.7 mL) | PGC Scientifics | 505-201 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | PBS |
| Pipette | VWR | 52947-948 | disposable, 3ml transfer pipette |
| Triton X-100 | Boehriner Mannheim | 789 704 | Dilute to 0.1% from stock |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | Dilute to 2% in PBS solution |
| Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) | ThermoFisher Scientific | MS-1352-RQ | |
| Rabbit Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| green emitting (520 nm) fluorochrome | Invitrogen | A11017 | Alexa-Fluor 488 |
| infrared emitting (652 nm) fluorochrome | Invitrogen | A21072 | Alexa Fluor 633 |
| Ethanol alcohol 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Dilute down to lower concentrations using PBS as needed |
| Solution-1 | Visikol Inc. | Visikol Histo-1 | |
| Solution-2 | Visikol Inc. | Visikol Histo-2 | |
| Skyes-Moore chambers | BellCo Glass Inc. | P/N 1943-11111 | |
| 25 gauge needle | ThermoFisher Scientific | 14-826AA | BD Precision Glide Needes |
| 3 mL syringe | ThermoFisher Scientific | 14-823-40 | BD disposable syringe |
| PDMS silicon sheets | McMaster-Carr | P/N 578T31 | |
| confocal microscope | Nikon Inc. | Nikon C1 Confocal Microscope | |
| Deconvolution software | Media Cybernetics | AutoQuant X22 | |
| Fiji image processing software | free, Open source software available at https://fiji.sc | ||
| Hematoxylin | Leica Biosystems | 3801570 | Component 1 of SelecTech H&E staining system |
| Alcoholic Eosin | Leica Biosystems | 3801615 | Component 2 of SelecTech H&E staining system |
| Blue Buffer | Leica Biosystems | 3802918 | Component 3 of SelecTech H&E staining system |
| Aqua Define MCX | Leica Biosystems | 3803598 | Component 4 of SelecTech H&E staining system |
| Immunohistochemistry detection system | ThermoFisher Scientific | TL-125-QHD | UltraVision Quanto Detection System HRP DAB |
Riferimenti
- Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. Biological features of placental programming. Placenta. 48, 47-53 (2016).
- Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years. J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).
- Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. Placental Origins of Chronic Disease. Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).
- Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies. J Pregnancy. 2014, 193925 (2014).
- Jones, C. J. P., Desoye, G. A new possible function for placental pericytes. Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).
- Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes. Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).
- Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta. Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).
- Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. 3-D study of vessels in peripheral placental villi. Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).
- Pearce, P., et al. Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries. PLOS ONE. 11 (10), 0165369 (2016).
- Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi. J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).
- Mayhew, T. M. A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies. J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).
- Teasdale, F. Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study. Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).
- Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. Modeling oxygen transport in human placental terminal villi. J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).
- Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Three-dimensional modeling of human placental terminal villi. Placenta. 43, 54-60 (2016).
