Gedroogd bloed en Serum vlekken als een nuttig instrument voor Sample opslag om te evalueren van kanker, Biomarkers
Summary
Dit protocol beschrijft een eenvoudige en handige methode voor het opslaan van perifeer bloed en serum/plasma voor downstream analyses uitgevoerd, zoals single nucleotide polymorphism (SNP) evaluatie en analyse ELISA.
Abstract
Bloed monster kwaliteit is van cruciaal belang om ervoor te zorgen nauwkeurige downstream analyses uitgevoerd, zoals real-time PCR of ELISA. Juiste opslag van biologische materialen is het uitgangspunt om reproduceerbare en betrouwbare resultaten te bereiken. Alle monsters moeten worden behandeld op dezelfde wijze uit bloed collectie naar opslag. Afhankelijk van de analyses worden uitgevoerd, moeten volbloed en serummonsters worden opgeslagen bij-20 ° C of -80 ° C tot gebruik. Bloed/serum monsters moeten ook worden aliquoted om te voorkomen dat meerdere bevriezen-ontdooien. Een ander belangrijk punt is de steekproef voorwaarden tijdens de verzending van een laboratorium naar de andere. Als droog ijs niet beschikbaar is of de verzending langer dan een paar dagen duurt, zijn alternatieve benaderingen nodig. É㠩 n optie is het gebruik van filtreerpapier voor bloedinzameling. Hier stellen wij een methode voor bloed en serum sample collectie die van profiteert gedroogd bloed vlekken (DBS) en gedroogd serum vlekken (DSS). We ontwikkelden de procedure om uit te pakken van DNA van DBS voor de downstream evaluatie van sommige één nucleotidepolymorfisme (SNPs) door real-time PCR. Wij ook een analyse van de ELISA vanaf eiwitten geëlueerd van DSS geoptimaliseerd. Deze methode kan worden gebruikt met andere ELISA testen of de procedures evaluatie van eiwitten.
Introduction
Het belangrijkste doel van het onderzoek naar kanker biomarkers is de identificatie van nieuwe biologische parameters die kunnen worden gebruikt voor diagnose, voorspellen patiënt prognose en voor het bepalen of een patiënt op een specifieke behandeling reageren zal. Deze onderzoekruimte is van fundamenteel belang voor de ontdekking van innovatieve kankerbehandelingen en speelt een sleutelrol in op maat gemaakte behandeling.
De procedures die zijn uitgevoerd tijdens elke stap van biomerker identificatie en validatie moet betrouwbaar en reproduceerbaar. Een hoeksteen voor het welslagen van translationeel onderzoek is de juiste opslag van biologische monsters zoals bloed en serum. Dit is de eerste stap op weg naar het verkrijgen van hoge kwaliteit biologisch materiaal dat kan worden gebruikt voor het moleculaire biologie-experimenten of eiwit tests uitvoeren.
Multicenter studies zijn vaak nodig om te werven genoeg patiënten om robuuste gegevens te verkrijgen. Niet alle instituten zijn in staat om op te slaan van de monsters bij-80 ° C of monsters verzenden naar andere internationale centra in droog ijs. Het gebruik van filtreerpapier voor bloedinzameling is een eenvoudige methode voor het opslaan van bloed en serum en vereist niet de onmiddellijke bevriezing van monsters1,2. Een druppel bloed of serum gespot kan worden op het papier, overgelaten aan droge overnachting en vervolgens opgeslagen voor maximaal 14 dagen bij kamertemperatuur1,2. Dit geeft onderzoekers tijd voor het verzenden van de monsters met andere laboratoria. Het gebruik van gedroogde bloed vlekken (DBS) en gedroogde serum vlekken (DSS) kon dus vereenvoudiging van de samenwerking tussen instituten in ontwikkelde en ontwikkelingslanden.
Gezien haar gebruiksgemak, wordt DBS bemonstering veel gebruikt in verschillende soorten testen voor serologische of genetische downstream analyses. Bijvoorbeeld, in het verleden, werden DBS vaak gebruikt voor HIV screening in ontwikkelingslanden1,2,3,4,5. Een ander voordeel van deze opslagmethode is dat bloedmonsters van vinger-prikt, waardoor het gebruik ervan voor pasgeboren screening tests 6,7,8kunnen worden verzameld. Eenvoudig voorbeeld verladen en het vervoer zijn verdere voordelen van DBS, vooral voor monsters die op externe sites waar er geen laboratoriumapparatuur is. In een eerdere publicatie gebruikten we DBS en DSS vitamine D en vitamine D-bindend-proteïne (DBP) testen in een reeks van Kaukasische en Afrikaanse patiënten9. Onze Afrikaanse collega’s waren niet in staat om droog ijs. Om te vergelijken de biologische markers om te begrijpen van de verschillen in de vitamine D-traject tussen de twee etnische bevolkingsgroepen, verbeterd we verder de procedure met behulp van gecompenseerde monsters opgeslagen onder normale omstandigheden en op filterpapier. Na het optimaliseren van de procedure DBS/DSS, konden we om DBP en vitamine D in het serum van de patiënt in beide cohorten te analyseren. Wij ook een aantal interne nucleotidepolymorfisme (SNPs) na DNA-extractie uit volbloed voor blanken en DBS voor Afrikanen9geëvalueerd. Dit protocol maakt hoge kwaliteit bloedmonsters bij kamertemperatuur worden opgeslagen zonder dat verschillende soorten downstream analyses, variërend van de moleculaire biologie tot ELISA testen. Het wordt aanbevolen voor gebruik voor het beheer van biologische materialen in multicenter studies of centra die nog geen voorzieningen voor standaard bewaarcondities. Het volgende protocol vertegenwoordigt het hoogtepunt van deze geoptimaliseerde procedures.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol onderzoekt de mogelijkheden voor het opslaan van bloed en serum op filterpapier wanneer de labs niet hebben het personeel of de infrastructuur die nodig is voor de juiste afhandeling van bloedmonsters. In het bijzonder, volledig bloed of serum verzameld in standaard buizen of door vinger-lul kan worden opgeslagen met behulp van deze methode en er is geen behoefte om te bevriezen van monsters bij-20 ° C of -80 ° C onmiddellijk na de bloedinzameling. DBS/DSS kan blijven tot 14 dagen zonder enige verandering …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zouden graag bedanken Gráinne Tierney voor redactionele ondersteuning.
Materials
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
Riferimenti
- Bertagnolio, S., et al. HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots. Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).
- Garrido, C., et al. Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola. J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).
- Steegen, K., et al. Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots. J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).
- Costenaro, P., et al. Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure. J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).
- Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns. BMC Pediatr. 20 (17), 172 (2017).
- Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2. Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).
- Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology. Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).
- Amadori, D., et al. Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway. Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).
- Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification. J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).
- Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings. J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).
- Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples. Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).
- St Julien, K. R., et al. High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification. PLoS One. 8 (5), e64710 (2013).
- Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry. Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).
